Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em> Drosophila</em
Summary
Santral sinir sistemi rejenerasyon ve onarım araştırmak Drosophila larva ventral sinir kablosu kullanarak bir yaralanma paradigma açıklanmıştır. Kasıtlı geliştirilen yazılım ve genetiği ile kantitatif analiz ile birlikte zaman atlamalı ve sabit örneklerde konfokal mikroskopi lazer tarama, ardından bıçaklama MSS rejenerasyon ve onarım moleküler mekanizmalarının araştırılması için kullanılır.
Abstract
Bir deneysel yöntem meyve sineği Drosophila kullanarak merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanma hücresel cevaplarının araştırılması için geliştirilmiştir. Hayvanlarda Anlama onarım ve rejenerasyon biyolojide önemli bir sorudur. Hasarlı insan MSS yeniden ve rejenerasyon teşvik etmek nasıl bir anlayış tıbbi nörobilim ana amaçlarından biridir gelmez. Drosophila güçlü genetik araç MSS yenilenme sorunu çözmek için kullanılabilir.
MSS ventral sinir kablosu (VNC, omurgalı omurilik eşdeğerdir) bir lezyon bir tungsten iğne ile elle uygulanır. VNC sonradan zamanla lezyon gelişimini takip amacıyla 24 saat için lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak time-lapse filme alınabilir. Alternatif olarak, daha sonra sabit ve konfokal mikroskopi ile nöron ve glial hücreleri görselleştirmek için immünofloresan kullanılarak boyandı, kültüre edilebilir. Cha, uygun işaretleri kullanmahasarının bir sonucu olarak hücre morfolojisi ve hücre durumda nges görselleştirilebilir. ImageJ ile ve bilerek geliştirilen eklentileri, niceliksel ve istatistiksel analizler zaman ve hücre proliferasyonu ve hücre ölümü ile yaralanmanın etkileri üzerinde yara boyutu değişiklikleri ölçmek için yapılabilir. Bu yöntemler büyük örneklem boyutlarının analizine izin verir. Onlar MSS rejenerasyon ve onarım altında yatan moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila güçlü genetik ile kombine edilebilir.
Introduction
Hayvanlarda Rejenerasyon hücreler organizmanın büyüme emretti ve tam zaman hissedebilir ve nasıl yapısal bütünlüğünü bir organizmanın sağlanması ve sürdürülmesi olduğunu ortaya koymaktadır. Hücrelerin bu gizemli yetenekleri anlama biyoloji ilgi büyük. Rejenerasyonu teşvik medikal sinirbilim için önemli hedeflerinden biridir. İnsanlarda hasarlı santral sinir sistemi (MSS) yenilenmez. Omurilik yaralanması Kemirgen modelleri hücrelerinin hasarı nasıl tepki anlamak için kullanılır. Ancak, etik kaygılar, yüksek maliyetler ve hayvanların yavaş yaşam döngüsü ilerleme sınırlamaktadır.
Meyve sineği Drosophila gelişimsel biyoloji ve nörobilim yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Güçlü genetik araçları ve kısa yaşam döngüsü sayesinde, Drosophila recurrently insan ve hastalığın anlaşılması için alaka ile genlerin fonksiyonlarının ve gen ağlarının keşfine yol açmıştır. Evrimsel con bol kanıt vardırinsanlara sinekler gen fonksiyonu servation.
Son yıllarda, sinir sistemi yaralanmaları için çeşitli paradigmalar Drosophila kurulmuştur. Bazı duyusal 1 ve motor aksonlar 2 dahil olmak üzere periferik sinirlerin kanat veya aksotomi koş periferik sinirlerin zarar oluşmaktadır. Ancak, periferik ve santral sinir sistemi birçok açıdan farklı, ve de birçok hayvanlarda periferik sinir sistemi CNS yapamam ise oluşturabildiği bilinmektedir. Böylece, CNS CNS rejenerasyon, doğrudan yaralanma anlamak daha uygun olacaktır. Bir iğne ile Stabbing yaralanma başarıyla yaralanma 3,4 yanıt araştırmak için Drosophila yetişkin beyin uygulanmıştır. Başka bir yaklaşım kullanarak, Ayaz ve ark. Kopmuş CNS bir Piezo elektrik microdissector sahip kültürlü yetişkin beyinlerinde aksonlar, ve 4 gün 5 için kendi rejenerasyon analiz. Bu daha sonra deney grubu u avantajıps onlar büyük ilgi şüphesiz beyin, odaklanmak olduğunu. Dezavantajı beynin sadece motor ve duyusal kontrolü ile uğraşan VNC, çok daha karmaşık olmasıdır. Erişkin beyni üzerine Çalışma aynı zamanda daha fazla zaman alıcıdır. Erişkin eclosion için yaklaşık 10 gün sürer ve sonra olgunlaşma için ek 5 gün ise larva, 4 gün içinde deneyler için hazır. Kaldırmak zordur kalın kütikül, kapsüllü çünkü yetişkin beyin, işlemek için de daha zordur. VNC omurgalı omuriliğe işlevsel olarak eşdeğer olan daha da cazibesi vardır.
Drosophila larvalarının yaygın nöroloji 6-9 için bir model organizma olarak kullanılır. Kesinlikle larva konuşma bir gelişim aşamasında olmasına rağmen, aynı zamanda bir hayvan tam olarak işlevsel olarak kabul edilebilir. Larva koku alma, tat ve nosisepsiyon, öğrenme ve bellek gibi hareket, farklı duyuları vardır. Böylece, larva VNC wgibi MSS yaralanma için ideal bir model olarak seçilmiştir.
Larva ve pupa VNCs hala 24 saat 10 için hücresel bütünlüğü koruyarak, çanak disseke ve kültüre edilebilir. Bu da yaralanma sonra bu süre boyunca için time-lapse kaydedilen veya bu süre içinde herhangi istenilen zaman bir noktada kültür ve sabit olabilir VNC, uygulanabilir öne sürdü.
Burada, Drosophila larva VNC kullanan MSS yaralanması için deneysel bir paradigma sunuyoruz. VNC ilk larva diseke edilir ve bıçaklama yaralanma bir tungsten iğne ile manuel olarak uygulanır. VNC sonra bir cam alt lamel üzerine yerleştirilir ve konfokal mikroskobu time-lapse lazer ile çekildi. Alternatif olarak, VNCs zaman istenilen süre kültüre edilebilir ve yaralanma hücresel etkileri immun ve konfokal mikroskopi kullanılarak sabit örneklerde analiz edilebilir. Yara alanı ölçülür, ve hücre nu kantitatif analiz edilebilirmber (hücre çoğalması ve hücre ölümü) kasıtlı olarak geliştirilmiş olan yazılım ile gerçekleştirilebilir. Büyük örnek boyutları kolayca istatistiksel geçerliliği sonuçları neden ele alınabilir. Bu yöntemler başarıyla MSS yaralanması 11 glial rejeneratif yanıtı yatan bir gen ağı keşfetmek için Drosophila güçlü genetik ile kombine edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz yaralanma, onarım ve yenilenmesi için hücresel yanıtları incelemektir Drosophila larva MSS yaralanması bıçaklama için bir protokol kurduk. Larva VNCs disseke ve zaman atlamalı mikroskopi ile filme veya glia ve nöronlara, apoptoz veya hücre bölünmesi görselleştirmek için floresan immun giderilen sonra, bıçaklandı edilir. Zaman içinde lezyonun ilerleme ölçülebilir. Bu yöntem yaralanması üzerine ve onarım sırasında hücre sayısı değişikliklerin niceliksel ve istatistiksel analiz için kasten geliştirilen yazılım eşlik ediyor.
Biz önce pupa ve daha sonra yetişkin sineğe geçiş 96 saat AEL larvaları (ve bu sabit veya daha da geliştirmek için izin verildi), gelişimsel bir sahne bıçakladı. Onlar Üçüncü dönem sahne ortasında, ve bu nedenle henüz pupa devresi geçiren değildir;; 96 saatte, VNCs bıçaklama için yeterince büyük ve sinir sistemi zaten reklamın buna tam olarak işlevsel benzerULT. Bu biraz daha larva vurmaya mümkün olabilir ve hassas zamanlama araştırma sorusuna uygun seçilmelidir. Ancak, yöneltilen sorulara bağlı olarak, genellikle yaralanma hücresel yanıtları gözlemlemek için bir süre kültür VNCs gerekli olacaktır. 120 saat AEL pupa devresi başlar bir süre sonra, bir süre MSS remodeled ve böylece zaman iyi kaçınılmalıdır. Böylece larva artı kültür bıçaklama için zaman penceresi oldukça sınırlıdır. Larvaları kullanılarak hala yetişkinler kullanarak üzerinde büyük bir teknik avantajı vardır: benzer yetişkin, iken, sinir sistemi hasarına yanıt analiz, zaten larvaları oldukça kolay ve hızlı tamamen işlevsel olmasıdır.
Bir tabak içinde kültür olmadan eşdeğer bir sonraki zaman noktasındaki disseke edilir VNCs bir çanak disseke ve kültüre beyinleri ve VNCs büyüklüğü ve morfolojisi karşılaştırırken, bu gelişme, in vivo daha kültürü yavaş görünür. Diğer açılardan,gelişimi normal kültür, doku bütünlüğü korunur ve hücreler canlı çoklu tepkiler gösteriyor sürdürmektedir. Yara genişleme, neuropile onarım ve glial proliferasyon 22 saat sonrası bıçaklama içinde yer alırlar. Bu yaralanma hücresel yanıtları kültüründe yer alan ve bir gün daha uzun eksplantlar korumak için gerek büyük olasılıkla olduğunu gösterir. Uzun süreli kültür arzu olsaydı, protokol bir kültür plaka ekleme 5 kullanma gibi daha fazla optimizasyon isteyebilir.
Bu yozlaşan olanlardan kaliteli örnekleri tespit etmek önemlidir. Bu protokol Optimize bazı beceri alır ve kaçınılmaz dejenerasyonu bazı örneklerde meydana gelecektir. VNC doku bütünlüğünün bozulmasına (Şekil 5B) yansıtan bir 'karnabahar' görünüm elde edebilirsiniz. Dejenerasyon ayrıca bağımsız olarak VNC dejenerasyon tarafından kabul edilmektedir (Şekil 5C bozulmamış, non-bıçaklandı örneklerde mevcut olabilir ki, bıçaklama </strong>). Bu örnekler atılmalıdır. Dejenerasyon büyük olasılıkla sinirler ve yüzey glia ise koruyucu tabaka gözyaşı kaba diseksiyonu, kaynaklanır. Böylece büyük bir özenle yavaşça incelemek için alınmalıdır. Diğer etkileyen faktörler olarak protokolde belirtilen yıkar ve zamanlara kesinlikle kalarak temiz tutulması ve antibiyotik ile alınmalıdır kültür ortamı, içerir. Sonuç olarak, iğne iğne ve iğne tutucu, boyut ve keskinlik uzunluğu çok önemlidir. Iğne tutucu kültür ortamı bulaşabilen ve künt bir iğne kendini tamir edemez ve yozlaşmaya yol açacak büyük bir yaralanmaya neden olabilir. Bu rutin iğne keskin sürdürmek için önemlidir.
Bu protokol, biz geleneksel gal4-UAS sistemini kullanarak glial süreçlerin görselleştirme paralel neuropile görselleştirmek için sinekler bir protein tuzak çizgi yararlandı. Bu araçlar, aynı zamanda, Le gibi diğer ikili ifade sistemleri ile birleştirilebilirgal4 bağımsız xA 19 ve Q-sistemi 20,. Bu hasarına yanıt olarak, akson ve glial süreçler arasında örneğin etkileşimlerin analizine olanak sağlayacak. Ayrıca, bu tür dendritler 21 veya kalsiyum girişini 22 gazetecilere gibi diğer genetik araçlar ile birleştirerek, bu yöntem glial hücreler, nöron akson ve MSS dendritlerin yaralanma tepki arkasındaki hücre biyolojisi analiz için büyük bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem yaralanma ve rejenerasyon yanıtları gen işlevi sınamak için, standart genetik mutasyonlar ve gen aşırı ekspresyonu ile kombine edilebilir.
Bu protokol başarıyla MSS yaralanması 11 rejeneratif glial yanıtı yatan bir gen ağının keşfine yol açmıştır. Bu hücresel olayları ve meyve sinekleri gen fonksiyonları çözülüyor, gen fonksiyonu evrimsel korunması göz önüne alındığında ma anlayışı hakkında önemli bilgiler sağlamak için muhtemeldiryaralanma ve rejenerasyon mmalian CNS yanıtı.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma ve bu çalışmanın kurs boyunca yaptıkları tartışmalar için laboratuvar diğer üyeleri için Mei Ann Lim ederim. Bu çalışma Yamada Bilim Vakfı ve Royal Society Kısa ziyaret Burslar ve KK AB Marie Curie Uluslararası Gelen Bursu GRR ve BBSRC Projesi Hibe (BB/H002278/1) ve Wellcome Trust Ekipman Hibe (073228/Z/03/Z) tarafından finanse edilmiştir AH
Materials
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O’Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
