Un paradigme d'enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em> Drosophila</em

1. Collection de larves par étapes Place 15 filles et 15 mouches adultes de sexe masculin dans une cage cylindrique en plexiglas pour pondre leurs œufs sur une boîte de Pétri avec de l'agar et le jus de raisin complété par une petite boule de pâte de levure pendant 3 heures à 25 ° C. Changer la plaque 3-4 fois par jour, et jetez la première plaque (c.-à partir de l'O / N oeuf-lay). Jetez également les plaques de la première journée. Dès le deuxième jour, gardez les plaques avec des œufs à 25 ° C. Après 7 jours de collecte des œufs, commencez avec une nouvelle mise en place des mouches parents. Après environ 24 heures, les larves éclosent des œufs. En accrochant les larves avec un pinceau ou dilué avec une paire de pinces, transférer 35 larves de l'agar de raisin dans un flacon contenant de la nourriture volée standard (10 ml) (figure 1A). Maintenir les flacons contenant des larves pendant 3 jours (96 heures après la ponte, AEL) à 25 ° C. 2. Dissection des larves Cordons nerveuse ventrale de la Culture Nettoyez êtrench et les mains avec de l'éthanol à 70%. Faire tremper 4 blocs de coloration, 2 paires de pinces et d'une aiguille avec de l'éthanol à 70%, et laisser sécher à l'air. Préparer 4 blocs de coloration avec les médias suivants: une avec de l'eau distillée (DW) à nettoyer et à larves piscine nettoyée, une deuxième avec 2 ml de bouclier et Sang M3 moyen insecte avec 1% de pénicilline et de la streptomycine, Ecdysone frais (M3 PS moyenne) de disséquer les larves, et un troisième avec 2 ml de M3 PS moyen de mettre en commun disséqués cordons nerveux ventral (VNC), et un quatrième avec 2 ml de M3 PS moyen de poignarder les VNC. Tous les réactifs doivent être préchauffée à la température ambiante. Ajouter de l'eau dans le flacon contenant 96 h AEL larves. Puis, à l'aide d'une spatule, écartez doucement la nourriture par les larves de la fiole sur une serviette en papier humide. Transférer 10 larves à un bloc de coloration contenant DW pour laver les aliments. Remplacer DW 6 fois. Puis remplacez-le par M3 PS support. Transfert un des larves à un bloc de coloration contenant 2 ml de milieu M3 PS. Sous une loupe binoculaire, dissect un cerveau larvaire avec soin en utilisant des méthodes standard 12, mais pour minimiser les dommages aux tissus, prendre des précautions particulières en procédant de la manière suivante. Placez la face dorsale larve haut, et la face dorsale moins un tiers de l'extrémité antérieure avec 2 paires de pinces (une dans chaque main). Tout en maintenant la partie antérieure, se détacher de l'extrémité postérieure de la pince, et à la déchirure de l'épiderme. Le cerveau et la VNC doit être visible depuis le bord postérieur de la moitié antérieure. Soin d'isoler le cerveau et complexe VNC en enlevant la graisse corporelle, de l'intestin et de l'épiderme. Lorsque les VNC sont trop endommagés, les VNC va dégénérer totalement ou partiellement, même sans avoir poignardé blessures. Prenez en compte les points suivants: Ne pas tirer ou arracher les disques imaginaux et des nerfs périphériques du thorax VNC car cela pourrait endommager la VNC. Pour couper les nerfs périphériques, maintenez les nerfs périphériques avec deux paires de pinces placées à proximité les uns les autres, puis tirez sur les nerfs avec l'd'cèpes. Disques imaginaux et des pièces buccales peuvent être laissés attachés à la VNC. Laisser la glande anneau et des ganglions lymphatiques attaché au cerveau. Couper le tube digestif au point le plus proche du cerveau, où la nourriture est pas très contenue. En utilisant un pipetman P20 avec le bout coupé et élargi un peu, transférer le VNC pour une salière contenant nouvelle M3 PS support. Avant de transférer le VNC, première pipette de haut en bas que le support utilisé pour la dissection afin d'éviter la VNC de coller à la pointe. 3. Stabbing blessures à la VNC Drosophile larvaire Cette section explique comment effectuer une blessure lancinante à la VNC, et de préparer poignardé-VNC pour time-lapse analyse et immunomarquage. Conditions de culture post-coup de poignard et la durée sont décrits à la section 5 (pour time-lapse analyse) et à l'article 6 (pour immunomarquage). Après la mise en commun suffisamment de VNC (4-5 pour time-lapseet plus de 24 pour immunomarquage), transférer une VNC pour une salière propre contenant M3 PS. Orientez le VNC pour que le neuropile dorsale est en vue sous le microscope à dissection (figure 1B). Telle est l'orientation la plus naturelle pour VNC pour s'allonger dans lorsqu'ils sont attachés à les lobes optiques. Stab manuellement à l'aide d'une aiguille de tungstène sous le microscope de dissection, de la face dorsale pratiquement à angle droit et de parvenir à la moitié de l'abdomen du VNC (figure 1B). Prenez une attention particulière à ce qui suit: Stab qu'une seule fois. Stab ce que l'aiguille touche le fond du verre. Attention cependant à ne pas endommager la pointe de l'aiguille. La tige du porte-aiguille ne doit pas toucher le milieu lors de coups de couteau. La blessure n'est pas visible sous le microscope de dissection. Remarque: Stab-accident sans rapport avec la dégénérescence La procédurepeut entraîner une dégénérescence cellulaire dans le VNC distincte de la lésion coups de couteau. Résultats dégénérescence des trous dans l'neuropile, et parfois des trous ont été observées dans le cortex des spécimens non poignardé. Les échantillons présentant une dégénérescence affectant la dégénérescence neuropile ou généralisée affecte également la surface VNC doit être jeté. Dégénérescence peuvent être identifiés comme suit: Surface rugueuse, en particulier dans la zone latérale / ventrale du thorax, à 22 h coup de couteau. Dans les cas extrêmes, la VNC semble saillie. Des trous ou des vacuoles dans la neuropile thoracique, qui peuvent être visibles en tant que signal de trous dans le fond avec immunomarquage fluorescence. 4. Entretien de l'aiguille et pince Vérifiez régulièrement si la pointe de l'aiguille est assez tranchant. La pointe de l'aiguille peut être tordue ou émoussée après l'avoir utilisé pour des expériences de plusieurs années. Dans ce cas, aiguiser la pointe à l'aide d'une pierre d'Arkansas ou équivalent. Les pointes de la pince doitrépondre parfaitement. Les conseils peuvent être endommagées avec l'usage. Dans ce cas, ajustez la pointe à l'aide d'une pierre Arkansas ou équivalent. 5. Enregistrement Culture et Time-lapse de VNC Poignardé Pour visualiser le neuropile axonale dans la vie VNC, une ligne GFP piège protéine qui qualifie tous les axones – G9 13 – peuvent être utilisés, et de visualiser toutes les cellules gliales (à l'exception de la glie ligne médiane), le pilote gliales repoGAL4 peut être utilisée pour exprimer la UASdsRed S197Y 14 journaliste. Par croisement G9 vole à UASdsRedS197Y;; repoGAL4 mouches, VNC de larves descendants sont obtenus avec des axones verts et des cellules gliales rouge qui peuvent être enregistrées dans les tissus vivants. Après la mise en commun VNC 5.4, transfert 1 VNC pour une salière propre contenant 2 ml de M3 PS, et le poignarder la moitié abdominale of the VNC, comme indiqué à la section 3. Transférer la poignardé VNC à une poly-L-lysine recouvert de verre 3,5 mm en bas boîtes de Pétri contenant 1 ml de M3PS. Placez le côté VNC dorsale vers le bas. Poussez doucement la VNC en utilisant le côté plat d'une paire de pince pour permettre à la VNC de coller au plat. Ajouter délicatement 1 ml de FBS M3 PS 15% rendant la concentration finale de FBS à 7,5%. Acquérir des images à l'aide microscopie confocale à balayage laser. Numériser le VNC, la collecte d'une série Z de section sur toute son épaisseur. Nous avons utilisé un Leica SP2 microscope inversé confocal avec une température de chambre de l'environnement contrôlé. Un microscope confocal équivalent devrait fonctionner, mais il peut exiger l'optimisation des paramètres de numérisation. Les paramètres de notre time-lapse de microscopie confocale ont été les suivantes: Température de la chambre de l'environnement: 25 ° C; 20X objectif avec zoom 4 fois; mode de balayage xyzt, avec une résolution de 512×512 pixels, z = 1 um et étapes de 1 heure ou 2 – intervalles d'une heure. Le microscope confocal Leica SP2 a une limitation de taille de fichier pour la numérisation. Avec ces paramètres, 8-9 points dans le temps peuvent être numérisés. Avecautres microscopie confocale, il devrait être possible d'acquérir des piles d'images pour les points de temps plus longues, c'est à dire sur la durée maximale de 24 heures. 6. Culture et immunocoloration de VNC poignardé et fixe Préparer une plaque de 24 puits de culture de tissu contenant 500 ul de FBS M3 PS 7,5% par puits. Répétez la dissection de plus de 24 VNC pour un plat de 24 puits de culture de tissu. En utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée, transfert 12 VNC non poignardé de la piscine à la boîte de culture, en utilisant 1 VNC par puits. Stab le reste de VNC dans la piscine comme décrit dans la section 3. Transférer chaque poignardé VNC à un puits chacun. Placer la capsule 24-puits dans un incubateur à 25 ° C pendant une durée souhaitée en fonction de l'expérience. L'intégrité des cellules n'est pas modifiée pendant au moins 24 heures. Après la culture, de transférer les 12 VNC dans 250 pi de PEM formaldéhyde à 4% dans un tube de 1,5 ml en utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée. Ensuite, la fixative est soigneusement pipette, en prenant soin de ne pas endommager les VNC. Une petite quantité de fixatif suffisante pour couvrir les échantillons doivent rester dans chaque tube. Par la suite, ajouter du fixateur frais et agiter doucement pendant 50 min à température ambiante. Rincer 2 fois avec du PBS 0,3% Triton X, puis laver 2 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante. VNC bloc par incubation avec du sérum de chèvre normal à 10% en 0,3% de Triton X PBS pendant 1 heure à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins un mois. Incuber VNC avec des anticorps primaires pendant plus de 20 heures à 4 ° C. Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante. Incuber VNC avec des anticorps secondaires pendant plus de 16 heures à 4 ° C. Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec du PBS 0,3% Triton X dans la salle de RT (dans le noir si vous utilisez des anticorps secondaires fluorescents). Remplacer PBS avec 50% de glycérol: 50% du PBS pendant au moins uneheures. Puis remplacez-le par du glycérol 80%: 20% de PBS pendant au moins une heure. Monter un VNC dans une fenêtre ménagée sur 2 couches de cello-bande (environ 0,06 mm) sur une lame de verre microscopie. Ajuster l'orientation, et placer une lamelle (18×18 mm) au-dessus de la fenêtre. Deux VNC peut être monté sur une glissière à l'aide de ce procédé. En utilisant une variété d'anticorps primaires, différentes réponses cellulaires à des blessures peuvent être analysés (par exemple les changements dans le nombre de cellules et la forme des cellules). 7. Analyser données à l'aide ImageJ et une gamme de plug-ins Si la VNC n'a pas poignardé la dégénérescence indépendant, l'échantillon doit être pris en compte dans l'analyse indépendamment de la taille des lésions. Comme coups de couteau se fait manuellement, la taille de la lésion est différente à chaque fois. Ainsi, il est important d'analyser statistiquement l'effet des coups de couteau, chaque fois que possible. Mesure de la taille des plaies. La taille de la plaie est un indicateur de réparation 15.La lésion est visible poignarder comme dépourvu d'expression de GFP. Zone de lésion peut être mesurée à l'aide des données de déchéance disponible gratuitement le logiciel ImageJ, comme suit: Utilisation ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales du menu "Fichier", sélectionnez "Importer" et de là, sélectionnez "séquence d'images". Cela transforme la collection d'images individuelles dans une pile. Suivant changer la "pile" dans un "HyperStack" en allant dans "Image" du menu, sélectionnez "HyperStack", puis sélectionnez "Stack à HyperStack". Définissez la taille de voxel en utilisant "Propriétés" du menu "Image". Dans les données acquises à l'aide du microscope confocal Leica SP2, la taille de voxel peut être obtenue à partir de l'analyse de logiciels, et à partir du fichier texte métadonnées enregistrées avec les images. Avec notre milieu tel que décrit dans la section 3, les dimensions en pixels sont xy = 0,366211 um et z = 0,99709 um. En examinant toutes les tranches dans un point dans le temps, dessiner le contour maximum de la zone de lésion avec l'outil polygone de sélection dans la barre d'outils. Il s'agit de laRégion d'intérêt (ROI). Ajouter le ROI au gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser" du menu, faites défiler et sélectionnez "Outils", puis "Gestionnaire de retour sur investissement", puis "ajouter". Répétez cette opération pour les tous les points de temps. Cliquez sur "Mesure" dans le gestionnaire de ROI pour obtenir la taille de la zone de chaque ROI. Correction du mouvement VNC pendant enregistrements time-lapse. "Stackreg" et "Turboreg" plugins 16 (à partir du site Web de ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): ces plugins permettent de corriger les mouvements de petits échantillons lors de time-lapse. Construire une pile avec une section optique équivalent représentant à travers tous les points de temps et d'appliquer les plugins. Il permet de visualiser la façon dont les changements des lésions dans le temps. Les détails sur ces méthodes et le manuel d'instructions sont disponibles du groupe de recherche qui a développé ces plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg /). Comptage automatique des cellules gliales. «Glie DeadEasy" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): il a été développé pour compter le nombre de REPO-positives cellules gliales dans le VNC Drosophila larves et d'examiner l'évolution des cellules gliales Numéro causé des blessures à coups de couteau 17. Le plug-in fonctionne correctement, avec une erreur de 0,1% de faux positifs et de faux négatifs de 4,3% 17. Pour utiliser ce plug-in, première étiquette toutes les cellules gliales (à l'exception de la ligne médiane) dans l'échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-REPO. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules gliales automatiquement au bout de 30 secondes. Comptage automatique des cellules apoptotiques. "Larves Caspase DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Elle a été développée pour compter le nombre de cellules marquées avec des anticorps anti-fendues-CASPASE3, et une nouvelle version a été adaptée pour les larves VNC. Stabbing blessure provoque une augmentation de la mort cellulaire programmée 11. Pour utiliser ce plug-in, les cellules apoptotiques première étiquette dans l'échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-fendues-Caspase-3 anticorps. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules apoptotiques automatiquement au bout de 30 secondes. 8. Réactifs Milieu de culture: Bouclier et moyennes Sang insectes M3, 7,5% de sérum de veau fœtal, 1% et la pénicilline streptomycine 1%. 0,01% de poly-L-lysine dans DW stérile. Fixateur: formaldéhyde à 4%, ultra pure dans PEM (0,1 M TUBES, 2 mM EGTA 1 mM, MgSO 4) solution. Solution de blocage pour immunomarquage: 10% de sérum de chèvre normal dans 0,3% de Triton X PBS. Anti-glutamine synthétase2 anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. Anticorps anti-GFP: 1:1000 dans une solution de blocage. Anti-REPO anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. Anti-ELAV anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. Anti-clivées Caspase 3 anticorps: 1:1000 dans une solution de blocage. Anticorps secondaires: 1:250 dans une solution de blocage.