Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em> Drosophila</em

1. Encenado coleção de larvas Lugar 15 do sexo feminino e 15 moscas machos adultos em uma gaiola cilíndrica Perspex para pôr ovos em uma placa de Petri com agar de sumo de uva e suplementados com uma pequena concha de levedura colar durante 3 horas a 25 ° C. Mudar a placa 3-4 vezes por dia, e descartar o primeiro prato (isto é, a partir de O / N ovo-lay). Descartar também as placas a partir do primeiro dia. A partir do segundo dia, manter as placas com os ovos a 25 ° C. Após 7 dias de coleta de ovos, comece com uma nova configuração de moscas pai. Após cerca de 24 horas, as larvas eclodem dos ovos. Ligando larvas com um pincel ou diluído com um par de pinças, transferir 35 larvas do agar de uva para um frasco contendo alimentos mosca padrão (10 ml) (Figura 1A). Manter os frascos contendo larvas por 3 dias (96 horas após a postura do ovo, AEL) a 25 ° C. 2. Dissecação de larval cordões nervosos ventrais para a Cultura Limpe sernch e as mãos com álcool 70%. Mergulhe 4 blocos de coloração, 2 pares de fórceps e uma agulha com etanol 70%, e deixar secar naturalmente. Prepare quatro blocos de coloração com as seguintes mídias: uma com água destilada (DW) para limpar e para as larvas piscina limpa, um segundo com 2 ml de Proteção e médio Sang M3 inseto com penicilina e estreptomicina 1%, ecdisona livre (M3 PS média) para dissecar as larvas, um terceiro com 2 ml de meio M3 PS para piscina dissecados cordas nervosas ventrais (VNCs), e um quarto com 2 ml de meio M3 PS stab VNCs. Todos os reagentes devem ser pré-aquecida até à TA. Adicionar água ao frasco contendo 96 hr larvas AEL. Em seguida, usando uma espátula, delicadamente espalhar comida com larvas do frasco para uma toalha de papel húmido. Transferem-se 10 larvas de um bloco de coloração contendo DW para lavar a comida. Substituir DW 6 vezes. Em seguida, substitua com M3 médio PS. Transfira uma das larvas para um bloco de coloração contendo 2 ml de meio M3 PS. Sob um microscópio de dissecação, dissect um cérebro larval cuidadosamente usando métodos padrão 12, mas para minimizar danos nos tecidos, ter um cuidado especial, procedendo da seguinte maneira. Coloque o lado dorsal larva, e segure o dorso de um terço da extremidade anterior com duas pinças (uma em cada mão). Enquanto segurando a seção anterior, afastar a extremidade posterior com a pinça, e rasgar a epiderme. O cérebro e o VNC deve ser visível a partir da borda posterior da metade anterior. Cuidadosamente isolar o cérebro e complexo VNC, removendo a gordura do corpo, intestino e epiderme. Quando os VNCs são danificados demasiado, as VNCs irá degenerar total ou parcialmente, mesmo sem lesão penetrante. Leve em conta os seguintes pontos: Não puxe ou rasgar os discos imaginais e os nervos periféricos do VNC torácica como isso irá danificar o VNC. Para cortar os nervos periféricos, manter os nervos periféricos com dois pares de fórceps colocados perto uns dos outros, e em seguida, puxe os nervos com o deceps. Discos imaginais e partes da boca pode ser deixado ligado ao VNC. Deixar a glândula anel e gânglio linfático ligado ao cérebro. Cortar o intestino, no ponto mais próximo para o cérebro, onde os alimentos não muito está contido. Ao utilizar um Pipetman P20 com a ponta cortada e se arregalaram um pouco, transfira o VNC a um bloco coloração contendo fresco M3 médio PS. Antes de transferir o VNC, pipeta primeiro para cima e para baixo, somente o meio utilizado para a dissecação, a fim de impedir que o VNC se colem à ponta. 3. Stabbing Lesão ao larval Drosophila VNC Esta seção descreve como executar lesão apunhalar os VNCs, e preparar-VNCs esfaqueado por lapso de tempo de análise e imunocoloração. Condições pós-esfaqueamento cultura e duração são descritos na seção 5 (por lapso de tempo de análise) e na seção 6 (para imunomarcação). Depois de reunir VNCs suficientes (4-5 para o lapso de tempoe mais 24 para imunomarcação), a transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo M3 PS. Orientar o VNC, de modo que o neurópilo dorsal está em vista sob o microscópio de dissecação (Figura 1B). Esta é a orientação mais natural para VNCs para deitar em quando ligado aos lobos óptica. Stab manualmente, utilizando uma agulha de tungsténio sob o microscópio de dissecação, a partir do lado dorsal praticamente em ângulo recto e com vista para a metade do VNC abdominal (Figura 1B). Tome especial atenção ao seguinte: Stab apenas uma vez. Stab até que a agulha atinge a parte inferior do vidro. No entanto, tenha cuidado para não danificar a ponta da agulha. A haste do suporte da agulha não deve tocar o meio durante esfaqueamento. A ferida não é visível ao microscópio de dissecção. Nota: degeneração Stab lesão não-relacionado O procedimentopode resultar em degeneração celular distinto dentro do VNC a partir da lesão penetrante. Resultados degeneração em furos no neurópilo e, ocasionalmente, os furos têm sido observados no córtex de espécimes não-stabbed. As amostras com degeneração afeta a degeneração neurópilo ou generalizado que afecta também a superfície VNC deve ser descartado. Degeneração podem ser identificados como se segue: Superfície áspera, especialmente na área lateral / ventral do tórax, em 22 horas de esfaqueamento. Em casos extremos, o VNC parece se projetava. Buracos ou vacúolos no neurópilo torácico, que pode ser visível como orifícios de sinal de fundo com a imunocoloração de fluorescência. 4. Manutenção de Agulha e Fórceps Rotineiramente verificar se a ponta da agulha é afiado o suficiente. A ponta da agulha pode ser dobrada ou romba depois usá-la para várias experiências. Neste caso, o aguçar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente. As pontas das pinças deveatender perfeitamente. As pontas podem ficar danificados com o uso. Neste caso, ajustar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente. 5. Cultura e lapso de tempo de gravação de VNCs Stabbed Para visualizar a neurópilo axonal no VNC vivo, uma linha de armadilha proteína GFP que rotula todos os axônios G9 – 13 – podem ser utilizadas, e para visualização de todas as células da glia (excepto a glia linha média) do condutor repoGAL4 glial pode ser usado para expressar o UASdsRed S197Y 14 repórter. Pelo cruzamento G9 voa para UASdsRedS197Y;; repoGAL4 moscas, larvas VNCs de progênie são obtidos com axônios verde e vermelho da glia que podem ser gravados em um tecido vivo. Após VNCs agrupamento 4-5, transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo 2 ml de M3 PS, e esfaquear o meia abdominal do VNC, como indicado na seção 3. Transfira o VNC esfaqueado a um poli-L-lisina 3,5 milímetros revestido prato fundo de vidro Petri contendo 1 ml de M3PS. Coloque o lado dorsal VNCs baixo. Com cuidado, empurre o VNC usando o lado liso de um par de fórceps para permitir que o VNC para manter o prato. Suavemente adicionando 1 ml de M3 PS FBS 15% tornar a concentração final de FBS a 7,5%. Aquisição de imagens usando o laser microscopia confocal. Digitalizar o VNC, coletando uma série Z-seção toda a sua espessura inteiro. Utilizou-se um microscópio invertido Leica SP2 confocal com uma temperatura da câmara de cultivo. Qualquer microscópio confocal equivalente deve funcionar, no entanto, ele pode exigir a optimização das condições para a exploração. Os ajustes para a microscopia confocal de lapso de tempo foram os seguintes: A temperatura da câmara de ambiente: 25 ° C; 20X objectiva com zoom 4 vezes; modo de digitalização xyzt, com resolução de 512×512 pixels, z = 1 uM e os passos de 1 hora ou 2 – intervalos de uma hora. A Leica microscópio confocal SP2 tem uma limitação no tamanho do arquivo para digitalização. Com essas configurações, 8-9 timepoints pode ser digitalizada. Comoutros microscopia confocal, que deveria ser possível adquirir pilhas de imagens para os pontos mais longos, ou seja, sobre a extensão de até 24 horas. 6. Cultura e imunocoloração de VNCs esfaqueado e Corrigido Prepara-se uma placa de 24 poços de cultura de tecido, contendo 500 ul de M3 PS 7,5% de FBS, por poço. Repita dissecção de mais de 24 VNCs para uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Ao utilizar o P20 Pipetman com a ponta de corte, transferir 12 VNCs não stabbed da piscina para o prato de cultura, utilizando-se um VNC por poço. Stab resto do VNCs na piscina, como descrito na seção 3. Transfira cada VNC esfaqueado a um bem cada. Coloque o prato de 24 cavidades na incubadora a 25 ° C durante um período desejado, dependendo da experiência. A integridade celular é inalterado durante pelo menos 24 horas. Após o cultivo, transferir os 12 VNCs em 250 ul de PEM de formaldeído a 4% em um tubo de 1,5 ml, utilizando o P20 Pipetman com a ponta de corte. Em seguida, o fixative é cuidadosamente pipetado para fora, tomando cuidado para não danificar os VNCs. Uma pequena quantidade de fixador suficiente para cobrir as amostras devem permanecer em cada tubo. Seguidamente, adicionar fixador fresco, e agitar suavemente durante 50 minutos à temperatura ambiente. Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, e em seguida, lavar duas vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente. VNCs bloco por incubação com soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS durante 1 h à RT. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos um mês. Incubar VNCs com anticorpos primários durante mais de 20 horas a 4 ° C. Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente. Incubar VNCs com anticorpos secundários durante mais de 16 horas a 4 ° C. Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X em PBS quarto RT (no escuro, se utilizando anticorpos fluorescentes secundárias). Substituir PBS com glicerol a 50%: 50% PBS durante, pelo menos, umahora. Em seguida, substitua com glicerol a 80%: 20% PBS durante pelo menos uma hora. Montar um VNC em uma janela feita em duas camadas de fita-violoncelo (aproximadamente 0,06 mm) sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Ajuste a orientação, e colocar uma lamela (18×18 mm) sobre a janela. Dois VNCs pode ser montado sobre uma lâmina utilizando este método. Utilizando uma variedade de anticorpos primários, diferentes respostas celulares à lesão pode ser analisada (por exemplo, alterações no número de células e a forma da célula). 7. Analisar dados usando ImageJ e uma gama de Plugins Se o VNC não tem stabbing degeneração relacionada, a amostra deve ser contado em para a análise, independentemente do tamanho da lesão. Como facada é feito manualmente, o tamanho da lesão é diferente a cada vez. Assim, é importante analisar estatisticamente o efeito de esfaqueamento, sempre que possível. Wound medição do tamanho. O tamanho da ferida é um indicador de reparação 15.A lesão esfaqueamento é visível como desprovido de expressão GFP. Área de lesão pode ser medido utilizando dados lapso livremente disponível software ImageJ, como se segue: Usando ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal de menu "Arquivo", selecione "Importar" e aqui selecionar "seqüência de imagens". Isto irá transformar a coleção de imagens individuais em uma pilha. Depois altere a "pilha" em um "Hyperstack", indo para "Imagem", selecione "Hyperstack", selecione "Pilha de Hyperstack". Defina o tamanho do voxel usando "Propriedades" do menu "Imagem". Nos dados adquiridos utilizando o microscópio Leica SP2 confocal, o tamanho do voxel pode ser obtido a partir da verificação de software, e a partir do ficheiro de texto de metadados guardada juntamente com as imagens. Com a nossa configuração como descrito na Seção 3, dimensões de pixels são XY = 0,366211 ^ m e z = 0,99709 jam. Ao examinar todas as fatias em um ponto de tempo, desenhe o contorno máximo da área de lesão com a ferramenta de polígono de seleção na barra de ferramentas. Este é oRegião de interesse (ROI). Adicione o ROI para o gerente de ROI, indo para "Analisar" menu, rolar para baixo e selecione "Ferramentas", depois em "gerenciador de ROI", depois em "adicionar". Repita este procedimento para os todos os pontos de tempo. Clique no botão "Medida" botão no gerenciador de ROI para obter o tamanho da área de cada ROI. Correção do movimento VNC durante lapso de tempo gravações. "Stackreg" e "Turboreg" plugins 16 (a partir do site ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): estes plugins permitem corrigir movimentos pequena amostra durante lapso de tempo. Construir uma pilha com uma seção representativa equivalente óptico através de todos os pontos de tempo e aplicar os plugins. Ela ajuda a visualizar como as mudanças de lesão ao longo do tempo. Os detalhes sobre esses métodos e ao manual de instruções estão disponíveis a partir do grupo de pesquisa que desenvolveu esses plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg /). A contagem automática de células gliais. "DeadEasy glia" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): esta foi desenvolvida para contar o número de células positivas para REPO gliais no larval Drosophila VNC e examinar a mudança no glial número causadas por esfaqueamento lesão 17. O plug-in funciona com precisão, com um erro de 0,1% de falsos positivos e falsos negativos 4,3% 17. Para usar este plug-in rótulo, primeiro tudo o glia (exceto a linha média) na amostra usando imunofluorescência com anticorpos anti-REPO. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células gliais automaticamente em cerca de 30 segundos. A contagem automática de células apoptóticas. "Larvas Caspase DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Este foi desenvolvido para contar o número de células marcadas com anticorpo anti–clivada Caspase3, e uma nova versão foi adaptada para os VNCs larvais. Stabbing lesão provoca um aumento da morte celular programada 11. Para usar este plug-in, as células apoptóticas primeira etiqueta na amostra usando imunofluorescência com anti-clivada-caspase-3 anticorpos. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células apoptóticas automaticamente em cerca de 30 segundos. 8. Reagentes Meio de cultura: Shield e Sang meio de insecto M3, 7,5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e estreptomicina 1%. 0,01% de poli-L-lisina em DW estéril. Fixador: formaldeído a 4%, em PEM Ultra puro (0,1 M PIPES, EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4) a solução. Solução de bloqueio para a imunocoloração: soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS. Anti-Glutamina Sintetase2 anticorpos: 1:250 em solução de bloqueio. Anti-GFP anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio. Anticorpos anti-REPO: 1:250 em solução de bloqueio. Anti-anticorpos ELAV: 1:250 em solução de bloqueio. Anti-caspase 3 clivada anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio. Anticorpos secundários: 1:250 em solução de bloqueio.