中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em>ショウジョウバエ</em

1。ステージングされた幼虫のコレクション 25℃で3時間貼り酵母の小さなスコップを添加した寒天とグレープジュースでシャーレに卵を産むための円筒状の風防ケージに入れ、15女性と15成人男性のハエ℃、プレート3-4回曜日を変更し、第1プレート（O / N卵産卵からIE）を捨てる。また初日からプレートを捨てる。 2日目から、25℃の卵でプレートを保つ卵を集めてから7日後、親ハエのセットアップ新しい始まります。 約24時間後、卵から幼虫が孵化。間伐絵筆でまたは鉗子のペアで幼虫をフックすることによって、ブドウ寒天から標準のフライ食品（10ミリリットル）（ 図1A）を含むバイアルに35幼虫を移す。 25℃で3日間幼虫（産卵後96時間、AEL）を含むバイアルを維持℃に 2。文化のための幼虫の腹側神経索の解剖ことを清掃70％エタノールでNCHと手。 70％エタノールで鉗子と針の4染色ブロック、2ペアを浸し、空気乾燥させます。 （M3 PSエクジソン無料、1％ペニシリンおよびストレプトマイシンをシールドとサンヒョンM3の昆虫培地2mlをもう1つ、きれいにし、幼虫を掃除プールになるように蒸留水（DW）を使って1次メディアと4染色ブロックを準備腹側神経索（VNCs）を解剖したプールにM3のPS培地2mlでサード;;と刺すVNCsをM3へのPS培地2mlを持つ第四の幼虫を解剖するための媒体）。すべての試薬を室温に予め温めなければなりません。 96時間AELの幼虫を含むバイアルに水を追加します。その後、へらを使って、そっと濡れたペーパータオルに上のバイアルからの幼虫を餌を広げた。食べ物を洗い流してDWを含む染色ブロックに10幼虫を移してください。 DW 6回交換してください。次にM3のPS培地と交換してください。 M3のPS培地2mlを含む染色ブロックに幼虫の1を移す。 解剖顕微鏡下で、ジ標準的な方法12を使用して慎重に幼虫の脳をssectが、組織の損傷を最小限に抑えるため、以下の方法で進めることで、特別な注意を払う。幼虫の背側を上に置き、鉗子の2ペア（それぞれの手で1つ）で前方端から3分の1に背側を保持します。前方部を保持しながら、鉗子で後端を引き離して、表皮を引き裂く。脳とVNCは前半の後縁から見えるはずです。慎重に体脂肪、腸、表皮を除去することによって、脳やVNCの複合体を単離する。 VNCsがあまりにも多くの被害を受けている場合、VNCsは怪我を刺しなくても、完全にまたは部分的に退化します。考慮に入れ、以下の点を取る： これはVNCを傷めますので、胸部のVNCから成虫および末梢神経を引っ張ったり、破れないようにしてください。末梢神経を切断するために、互いに近接して配置された鉗子2対の末梢神経を押しながら、ために神経を引っ張るCEPS。成虫と口の部分は、VNCに添付しておくことができます。 脳に接続されているリング腺やリンパ腺のままにしておきます。 過言ではない食品が含まれている、脳に最も近い時点で腸を切った。 先端はカットオフと少し広がったとP20のピペットマンを使用することにより、新鮮なM3のPS培地を含む染色ブロックにVNCを転送します。 VNCを転送する前に、最初のヒントに付着VNCを防ぐために、解剖の目的のみに使用される培地をピペッティングします。 3。 ショウジョウバエ幼虫VNCに傷害を刺すこのセクションでは、VNCsに刺すような傷害を実行すると、時間経過の解析と免疫染色のために刺さ-VNCsを準備する方法について説明します。ポスト刺す培養条件と期間は、第5条（タイムラプス解析用）および第6条（免疫染色用）で説明されています。 時間経過に十分なVNCs（4-5をプールした後、と）免疫染色のための24の上に、M3のPSを含むクリーンな染色ブロックに1 VNCを転送します。 オリエントVNCはとても背神経網は、解剖顕微鏡（ 図1B）の下に表示されていること。これは、視神経のローブに接続したときに嘘をつくVNCsにとって最も自然な方向である。 刺す手動で直角に事実上背側から、解剖顕微鏡下でタングステン針を使用し、VNCの腹部の半分（ 図1B）を目指す。 以下に特に注意してください： 一度だけ刺す。 針刺すまでは、グラスの底を打つ。しかし、針の先端を損傷しないように注意してください。 持針器の茎が刺す時に媒体を触れてはならない。 傷は解剖顕微鏡下で可視ではありません。 注：刺し傷無関係変性手順刺すような病変からVNC異なる内細胞変性をもたらすことができます。神経網の穴の変性の結果、たまに穴が非刺さ標本の皮質で観察されている。また、VNCの表面に影響を与える神経網または広範な変性に影響を及ぼす変性症検体は廃棄しなければならない。変性は、次のように識別することができます： 刺殺の22時間で、特に胸部の横/腹側領域での粗面、、。極端なケースでは、VNCが突出して見えます。 蛍光免疫染色によるバックグラウンド信号の穴のように見えることができます胸部神経網の穴または液胞。 4。針や鉗子のメンテナンス日常的に針の先端が十分にシャープであるか​​どうかを確認します。針の先端は、いくつかの実験のためにそれを使用した後に曲がったり鈍することができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端をシャープに。 鉗子の先端を行う必要があり完璧に満たしています。ヒントは、使用に損傷を受けることができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端を調整します。 5。刺さVNCsの文化とタイムラプス録画 G9 13 – -リビングVNC、すべての軸索をラベル付けしGFPタンパク質トラップラインの軸索の神経網を可視化するために使用することができ、すべてのグリア細胞（正中グリア除く）を可視化するためにグリアドライバrepoGAL4はUASdsRedを表現するために使用することができますS197Y 14レポーター。交差点G9によってUASdsRedS197Yに飛ぶ;; repoGAL4ハエ、子孫の幼虫からVNCsは、生体組織に記録することができます緑の軸索とグリア赤で得られる。 プーリング4-5 VNCs後、VNCのきれいな染色M3 PSの2ミリリットルを含むブロック、そして、スタブへの転送1 VNC腹部の半分は、セクション3で示されている。 M3の1ミリリットルを含むポリ-L-リジンコートさ3.5ミリメートルのガラスボトムシャーレに刺さVNCを転送PS。 VNCs背側を下にして置きます。優しくVNCは皿に固執できるように鉗子の平らな面を使ってVNCを押してください。 穏やかに7.5％にFBSの最終濃度をレンダリングM3 PS 15％のFBSの1 mlを加える。 レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて画像を取得する。その全体の厚さ全体のZセクションシリーズを収集し、VNCをスキャンします。我々は、温度制御された環境チャンバーとライカSP2倒立共焦点顕微鏡を使用していました。これらに相当する共焦点顕微鏡は動作するはずです、しかし、それは検索の設定の最適化を必要とするかもしれません。当社タイムラプス共焦点顕微鏡の設定は以下の通りであった：環境室の温度：25℃、4倍ズームと20倍対物レンズ、スキャンモードxyzt、512×512ピクセルの解像度では、z = 1μmステップ、1時間または2 – 時間間隔。 ライカSP2共焦点顕微鏡は、走査型のファイルサイズには限界がある。これらの設定で、8月9日の時点でスキャンすることができます。ととも​​に他の共焦点顕微鏡は、それはすなわち 、最大24時間までのスパンで、長い時間ポイントのために画像スタックを取得することが可能であるべきである。 6。刺さおよび固定VNCsの文化や免疫染色ウェルあたりM3 PS 7.5パーセントFBSの500μlを含む24ウェル組織培養プレートを準備します。 24ウェル組織培養皿のための24以上のVNCsの解剖を繰り返します。 先端カットオフとP20のピペットマンを使用することにより、ウェル当たり1 VNCを使用して、培養皿にプールから12非刺さVNCsを転送します。 セクション3で説明したように、プール内VNCsの刺す残り。各ウェルにそれぞれ刺しVNCを転送します。 実験に応じて所望の持続時間のために25℃のインキュベーター内で24ウェル皿を置きます。細胞の完全性は、少なくとも24時間、変更されません。 培養後、先端のカットオフとP20のピペットマンを用いて1.5 mlチューブで4％ホルムアルデヒドPEMの250μlの12 VNCsを転送します。その後、fixatiVEは慎重VNCsを傷つけないように注意しながら、外にピペッティングします。サンプルをカバーするのに十分な固定剤の少量を各チューブに残るべきである。その後、新鮮な固定液を追加して、穏やかに室温で50分間攪拌する。 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、その後室温で0.3％トリトンX PBSで10分間2回洗浄する。 室温で1時間、0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清と共にインキュベートすることによりブロックVNCs。サンプルは、少なくとも1ヶ月間、4℃で保存することができます。 4℃以上20時間一次抗体とともにVNCsをインキュベート℃に室温で0.3％トリトンX PBSで10分間3回洗浄した後、0.3％トリトンX PBSで2回すすいでください。 4℃以上で16時間二次抗体とVNCsをインキュベート℃に 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、次いで室温RT（暗闇の中で蛍光二次抗体を使用している場合）で0.3％のTriton X PBSで10分間3回洗浄します。 少なくとも、50％PBS：50％グリセロールを含むPBSを交換してください時間。 その後、80％グリセロールで置き換える：20％PBSを少なくとも1時間。 顕微鏡のスライドガラス上のチェロテープの2層（約0.06ミリメートル）で行われたウィンドウにVNCをマウントします。向きを調整して、ウィンドウの上にカバーグラス（18×18 mm）を配置します。二つVNCsは、このメソッドを使用してスライドにマウントすることができます。 一次抗体のさまざまな方法を使って、怪我に異なる細胞応答（細胞数および細胞の形状変化など ）を分析することができる。 7。 ImageJとプラグインの範囲を使用してデータを分析 VNCは無関係変性を刺していない場合は、サンプルは病変の大きさにかかわらず、分析のためにカウントする必要があります。刺殺は手動で行うように、病変の大きさはその都度異なります。したがって、統計的には可能な限り、刺すことの効果を分析することが重要です。 サイズ測定を巻いた。傷の大きさは、修理15の指標である。刺すような病変は、GFPの発現を欠くとして表示されます。次のように病変領域は、自由に利用できるImageJのソフトウェアを使用して失効データを測定することができる： ImageJを使って、 "ファイル"メニューから、共焦点画像スタックを開き、 "インポート"を選択し、ここから "画像シーケンス"を選択します。これはスタックに個々のイメージのコレクションを向けるだろう。 次に "イメージ"メニューに移動して "Hyperstack"に "スタック"を変更、 "Hyperstack"を選択し、 "Hyperstackにスタック"を選択します。 "イメージ"メニューから "プロパティ"を使用してボクセルサイズを設定します。ライカSP2共焦点顕微鏡を用いて取得したデータでは、ボクセルサイズは、走査ソフトウェアから、画像と一緒に保存されたメタデータのテキストフ​​ァイルから取得することができます。第3節で説明したように我々の設定では、ピクセル寸法は、xy = 0.366211程度とz = 0.99709程度である。 1時点のすべてのスライスを調べることによって、ツール·バーに多角選択ツールで病変領域の最大輪郭を描画します。これは関心領域（ROI）。 メニューの "分析"に行くことによって、ROIマネージャーにROIを追加し、 "追加"、スクロールダウンして、 "ツール"、次に "ROIマネージャー"を選択します。 すべての時点にこれを繰り返します。 各ROIの領域のサイズを取得するためのROIマネージャーに "測定"ボタンをクリックします。 タイムラプス録画時にVNCの動きの補正。 "Stackreg"と"Turboreg"プラグイン16（ImageJのウェブサイトからhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）：これらのプラグインは、時間経過の間に少量のサンプルの動きを補正することができます。すべての時間のポイントを通って同等の代表光学部を使用してスタックを構築し、プラグインを適用します。それは、時間の経過とともにどのように変化する病変を可視化するのに役立ちます。これらのメソッドの詳細については、取扱説明書では、これらのプラグインを開発した研究グループから提供されています。 （ http://bigwww.epfl.cH / thevenaz / stackreg /）。 グリア細胞の自動カウント。 "DeadEasyグリア"プラグイン（ www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ）：これは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCのレポ陽性グリア細胞の数をカウントするとグリアの変化を調べるために開発されました数が17を刺した傷害によって引き起こされる。プラグインは、0.1パーセント、偽陽性、4.3％偽陰性17のエラーで、正確に動作します。このプラグインは、最初のラベルに抗REPO抗体で免疫蛍光を用いて検体中のすべてのグリア（正中線を除く）を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にグリア細胞をカウントします。 アポトーシス細胞の自動カウント。 "DeadEasyカスパーゼの幼虫"プラグイン（ www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html）18：これは、抗切断され、カスパーゼで標識された細胞の数をカウントするために開発され、新しいバージョンが幼虫VNCs用に脚色された。刺すような傷害は、プログラムされた細胞死11の増加を引き起こす。 、このプラグインは抗切断さカスパーゼ-3抗体で免疫蛍光を用いて試料の最初のラベルアポトーシス細胞を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にアポトーシス細胞をカウントします。 8。試薬培地：シールドとサンヒョンM3の昆虫培地、7.5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン及び1％ストレプトマイシン。 無菌DWの0.01パーセントポリ-L-リジン。 固定：4％ホルムアルデヒド、PEMの超純（0.1Mパイプ、2mMのEGTA、1mMのMgSO 4）し、ソリューションを提供します。 免疫染色用ブロッキング液：0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清。 アンチグルタミンシンテ2抗体：ブロッキング溶液で1:250。 抗GFP抗体：ブロッキング溶液で1:1000。 抗REPO抗体：ブロッキング溶液で1:250。 抗ELAV抗体：ブロッキング溶液で1:250。 抗切断カスパーゼ3抗体：ブロッキング溶液で1:1000。 二次抗体：ブロッキング溶液で1:250。