פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em> דרוזופילה</em
Summary
הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.
Abstract
שיטה ניסיונית פותחה כדי לחקור את התגובות התאיות למערכת עצבים מרכזיות (CNS) באמצעות פגיעת זבוב פרות דרוזופילה. תיקון הבנה והתחדשות בבעלי חיים הוא שאלת מפתח בביולוגיה. מערכת העצבים מרכזיים האדם שנפגעה אינה מתחדשת, וההבנה כיצד לקדם ההתחדשות היא האחת מטרות העיקריות של רפואת מדעי המוח. ערכת כלים הגנטית הרבה העצמה של דרוזופילה ניתן להשתמש כדי להתמודד עם הבעיה של התחדשות מערכת עצבים מרכזיים.
נגע לצינור עצבי גחון CNS (VNC, שווה ערך לחוט שדרת חוליות) מיושם באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC לאחר מכן ניתן יהיה צולם בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת ליזר של עד 24 שעות לעקוב אחר התפתחותו של הנגע לאורך זמן. לחלופין, הוא יכול להיות מתורבת, אז קובע ונצבע באמצעות immunofluorescence לדמיין נוירון ותאי גליה עם מיקרוסקופיה confocal. שימוש בסמנים מתאימים, צ'הnges במורפולוגיה של תא ותא המדינה כתוצאה מפציעה יכולה להיות חזותי. עם ImageJ ובכוונה פתח תוספות, ניתוחים כמותיים וסטטיסטיים יכולים להתבצע כדי למדוד שינויים בגודל פצע לאורך זמן ואת ההשפעות של פגיעה בתרבות של תאים ומוות של תאים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח של מדגמים גדולים. הם יכולים להיות משולבים עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.
Introduction
התחדשות בחיות מגלה כי תאים לחוש כאשר צמיחת האורגניזם הוא הורה ושלם, וכיצד מבני שלמות האורגניזם מושג ומתוחזק. הבנת היכולות המסתוריות של תאים היא עניין רב בביולוגיה. קידום התחדשות הוא אחד מהיעדים המרכזיים לרפואת מדעי המוח. בבני אדם, מערכת העצבים המרכזית הפגועה (מערכת עצבים מרכזיים) אינה מתחדשת. מכרסמים של פגיעה בחוט שדרה משמשים להבין כיצד תאים מגיבים לפציעה. עם זאת, שיקולים אתיים, עלויות גבוהות ומחזור החיים של בעלי החיים האיטי להגביל התקדמות.
זבוב פרות דרוזופילה היא אורגניזם מודל שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ומדעי המוח. תודה לכלים רבים עצמה הגנטיים ומחזור חיים קצר, דרוזופילה הובילה חוזרת ונשנתה לגילוי פונקציות גנים ורשתות גנים עם רלוונטיות להבנה של בני אדם ומחלות. יש ראיות רבות לקון אבולוציוניתservation של תפקוד גן מזבובים ובני האדם.
בשנים האחרונות, כמה פרדיגמות בגין ניזקי מערכת עצבים הוקמו בדרוזופילה. חלק מורכב של פגיעה בעצבים היקפיים שרצים לאורך הכנף או axotomy של עצבים היקפיים, כולל 1 חושי והמוטוריים אקסונים 2. עם זאת, במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית שונות במובנים רבים, וזה ידוע שבעלי חיים רבים במערכת העצבים ההיקפית יכולה להתחדש ואילו מערכת העצבים המרכזיים לא יכולה. לכן, כדי להבין את התחדשות מערכת עצבים מרכזיים, פגיעה ישירה למערכת העצבים המרכזיים הוא יותר מתאים. פציעת דקירה במחט כבר מיושם בהצלחה במוח הבוגר תסיסנית לחקור תגובה לפציעת 3,4. שימוש בגישה אחרת, Ayaz et al. האקסונים במערכת עצבים מרכזיים כרותים במוחות בוגרי תרבית עם Piezo הכח microdissector, ונתחו התחדשותם במשך 4 ימים 5. היתרון של אלה u הסט מאוחר יותר הניסיונינ.ב. הוא שהם מתמקדים במוח, שהוא ללא ספק עניין רב. החסרון הוא שהמוח הוא הרבה יותר מורכב מVNC, שעוסק אך ורק עם מנוע ובקרה חושית. עובד על המוח המבוגר הוא גם זמן רב יותר. הזחל מוכן לניסויים ב4 ימים, בעוד שזה לוקח בערך 10 ימים לeclosion המבוגר, ולאחר מכן 5 ימים נוספים להבשלה שלהם. המוח המבוגר הוא גם קשה יותר לטיפול, משום שהוא מגולם בציפורן עבה, שקשה להסיר. VNC יש אטרקציה הנוספת של להיות פונקציונלי שווה חוליות עמוד השדרה.
זחל תסיסנית נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל למדעי המוח 6-9. למרות שרשמית הוא הזחל בשלב התפתחותי, זה יכול להיות גם נחשב חיה מתפקדת במלואה. הזחל יש חושים, תנועה מרובים כולל olfaction, טעם וnociception, ולמידה וזיכרון. לפיכך, הזחל VNC wכנבחר כמודל האידיאלי לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים.
VNCs זחל וגלמים ניתן גזור ותרבית בצלחת, עדיין שמור על יושרה סלולרית לתקופה של עד 24 שעות 10. זה הציע כי פגיעה יכולה להיות מיושמת על VNC, שאז יכול להיות מוקלט בזמן לשגות במשך פרק זמן זה, או בתרבית וקבועה בכל נקודת זמן רצוי בתוך תקופה זו.
כאן, אנו מציגים פרדיגמה ניסויית לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים באמצעות רימות דרוזופילה VNC. VNC היא גזורה ראשונה מהזחל, ופציעת דקירה מיושמת באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC מניח בcoverslip זכוכית תחתונה, וצולם בליזר זמן לשגות מיקרוסקופיית confocal. לחלופין, את יכול להיות מתורבת VNCs לתקופה רצויה של זמן, ואת ההשפעות הסלולר של פציעה ניתן לנתח בדגימות קבועות באמצעות immunostaining ומיקרוסקופיה confocal. אזור הפצע ניתן למדוד, וניתוח כמותי של תא נוmber (שגשוג תאים ומות תאים) יכול להתבצע בתוכנה שפותחה בכוונה. מדגמים גדולים ניתן לטפל בקלות, וכתוצאה מכך תוצאות תוקף סטטיסטי. שיטות אלו היו משולבות בהצלחה עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לגלות רשת גנים שבבסיס תגובת משובי גלייה לפציעת מערכת עצבים מרכזיים 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקמנו פרוטוקול לדקירת פגיעה במערכת העצבים המרכזיים תסיסנית הזחל כדי לחקור את התגובות התאיות לניזקים, תיקון והתחדשות. VNCs זחל הם גזורים ונדקר, לאחר שהם צולמו עם מיקרוסקופיה זמן לשגות או קבועים לimmunostaining פלואורסצנטי לדמיין גליה ונוירונים, אפופטוזיס או חלוקת תא. ההתקדמות של הנגע לאורך זמן ניתן למדוד. שיטה זו מלווית בתוכנה שפותחה בכוונה לניתוח הכמותי וסטטיסטי של שינויי מספר תא על פגיעה, ובמהלך התיקון.
אנחנו נדקרנו זחלי 96-AEL שעה (ואלה היו קבועים או אפשרו לפתח עוד יותר), שלב התפתחותי לפני המעבר לגולם ולאחר מכן לטוס למבוגרים. בגיל 96 שעות, VNCs גדול מספיק לדקירה, הם באמצע שלב instar השלישי, ולכן לא מבצע התגלמות עדיין; ומערכת העצבים היא כבר מלא פונקציונלית דומה לזה של המודעהult. זה עשוי להיות אפשרי לדקור מעט מאוחר יותר בזחלים והתזמון המדויק יש לבחור כדי להתאים לשאלת המחקר. עם זאת, בהתאם לשאלות המופנות, זה בדרך כלל יהיה צורך לתרבות את VNCs במשך זמן מה כדי לבחון את התגובות התאיות לפציעה. זמן מה לאחר 120 התחלות התגלמות AEL HR, תקופה שבה מערכת העצבים המרכזיים היא שופצה ולכן הוא נמנע טוב ביותר. לכן חלון הזמן לדקירת התרבות בתוספת בזחל הוא די מוגבל. שימוש זחלים עדיין יש יתרון טכני רב על שימוש במבוגרים: בעוד, בדומה למבוגרים, מערכת העצבים הוא כבר מתפקד במלואה, ניתוח התגובה לפציעתו קלה ומהיר יותר במידה ניכרת בזחלים.
כאשר משווים את הגודל והמורפולוגיה של המוח וVNCs הגזורים ותרבית בצלחת לVNCs שנתחו בנקודה זהה כעבור זמן בלי culturing בצלחת, נראה כי ההתפתחות היא איטית יותר בתרבות מאשר בגוף חי. במובנים אחרים,הפיתוח ממשיך בדרך כלל בתרבות, יושרת רקמה נשמרה ותאי חיים מראים תגובות אפשריות. התרחבות פצע, תיקון neuropile וריבוי גליה להתבצע בתוך 22 שעתי הודעת דקירה-. זה מראה כי תגובות תאיות לניזקים תתקיימנה בתרבות, ויש סיכוי טוב ביותר לא צריך לשמור את explants ליותר מיום אחד. אם תרבות טווח ארוך יותר הייתה רצויה, הפרוטוקול עשוי לדרוש אופטימיזציה כגון באמצעות הוספת צלחת תרבות 5 נוספת.
חשוב לזהות דגימות באיכות טובה מאלה המנוונים. אופטימיזציה של פרוטוקול זה לוקח קצת מיומנות ובהכרח התנוונות תתרחש בדגימות מסוימות. VNC יכול לרכוש מראה 'כרובית' שמשקף את ההתמוטטות של שלמות רקמות (איור 5 ב). ניוון גם מוכר על ידי vacuolization של VNC באופן עצמאי מדקירה, שיכול להיות נוכח בדגימות שאינן שלמות, נדקרו-(איור 5 ג </strאונג>). דגימות אלה חייבות להיות מושלכות. הניוון נגרם ככל הנראה על ידי נתיחה גסה, שיכול לקרוע את עצבים ואת שכבת המגן של גליה פני שטח. טיפול כך גדול יש לנקוט כדי לנתח בעדינות. גורמים המשפיעים אחרים כוללים התרבות הבינונית, אשר חייב להישמר נקי ועם אנטיביוטיקה, הקפדה על הכביסות ותזמונים כמפורט בפרוטוקול. לבסוף, אורכו של מחזיק המחט ומחט, הגודל והחדות של המחט הם חשובים מאוד. בעל המחט יכול לזהם את התרבות הבינונית ומחט קהה יכולה לגרום פגיעה גדולה שלא יכול לתקן את עצמו ויביא לניוון. חשוב באופן שגרתי כדי לשמור את המחט חדה.
בפרוטוקול זה, לקח את היתרון של קו מלכודת חלבון של זבובים לדמיין neuropile במקביל להדמיה של תהליכי גליה באמצעות המערכת המסורתית GAL4-כטב"מ. כלים אלו יכולים גם להיות משולבים עם מערכות ביטוי בינאריות אחרות כגון LeXA 19 ו 20 ש-מערכת, אשר אינם תלויים בGAL4. הדבר יאפשר הניתוח של אינטראקציות, למשל, בין אקסונים ותהליכי גליה, בתגובה לפציעה. על ידי שילוב אותו עוד יותר עם כלים גנטיים אחרים כגון כתבים לדנדריטים 21 או זרם סידן 22, שיטה זו מספקת הזדמנות מצוינת לנתח את הביולוגיה של התא מאחורי תגובת פציעתם של תאי גליה, אקסונים ודנדריטים עצביים במערכת העצבים המרכזיים. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם גנטיקה רגילה, מוטציות וביטוי יתר של גנים, כדי לבדוק את תפקוד גן בתגובה לפציעה והתחדשות.
פרוטוקול זה הוביל בהצלחה לגילוי של רשת גנים שבבסיס תגובת גליה משובים לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים 11. בהתחשב השימור האבולוציוני של תפקוד גן, נפרם האירועים הללו סלולריים ופונקציות גן בפרותי זבובים עשוי לספק תובנה משמעותיות להבנה של maCNS mmalian תגובה לפציעה והתחדשות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למיי אן לים לקריאה ביקורתית של כתב היד ושאר חברי המעבדה שלנו לדיונים שלהם ברחבי במהלך עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מלגות לביקור קצרות חברה מלכותית יאמאדה קרן מדע והאיחוד האירופי וgrr מארי קירי הבינלאומי נכנס למלגת KK, וBBSRC הפרויקט גרנט (BB/H002278/1) וקרן Wellcome ציוד גרנט (073228/Z/03/Z) לAH
Materials
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O’Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
