Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em> Drosophila</em

Ein. Sammlung von Inszenierte Larven Platz 15 weiblichen und 15 männlichen erwachsenen Fliegen in einem zylindrischen Plexiglas Käfig Eier auf einer Petrischale lag mit Agar und Traubensaft mit einer kleinen Schaufel von Hefe für 3 Stunden bei 25 ° C fügen ergänzt Ändern Sie die Platte 3-4 mal am Tag, und entsorgen Sie die erste Platte (dh von der O / N Ei-lay). Entsorgen Sie auch die Platten vom ersten Tag an. Ab dem zweiten Tag auf, halten die Platten mit Eiern bei 25 ° C. Nach 7 Tagen Eier sammeln, mit einen neuen Schnitt der Muttergesellschaft Fliegen eingestellt starten. Nach ca. 24 h, Larven schlüpfen aus den Eiern. Durch Einhaken Larven mit einem ausgedünnten Pinsel oder mit einer Pinzette, übertragen 35 Larven aus der Traube Agar einem Fläschchen mit Standard-fly Speisen (10 ml) (Abbildung 1A). Pflegen Sie die Fläschchen mit Larven für 3 Tage (96 Stunden nach der Eiablage, AEL) bei 25 ° C. 2. Dissektion der Larven Ventral Nervenstränge für Kultur Sauber seinnch und Hände mit 70% Ethanol. Soak 4 Färbung Blöcke, 2 Paar Pinzette und eine Nadel mit 70% Ethanol und Luft trocknen lassen. Bereiten Sie 4 Färbung Blöcke mit den folgenden Medien: ein mit destilliertem Wasser (DW) zu reinigen und zu Pool gereinigt Larven, eine zweite mit 2 ml Shield und Sang M3 Insekten Medium mit 1% Penicillin und Streptomycin, Ecdysone-free (M3 PS mittel), um die Larven zu sezieren, eine dritte mit 2 ml M3 PS mittel Pool seziert ventral Nervenstränge (VNCs) und ein Viertel mit 2 ml M3 PS Medium zu erstechen die VNCs. Alle Reagenzien müssen RT vorgewärmt werden. Fügen Sie Wasser in die Durchstechflasche mit 96 hr AEL Larven. Dann wurde unter Verwendung eines Spatels, sanft verteilen Lebensmittel mit Larven aus dem Fläschchen auf einen feuchten Papiertuch. Übertragen 10 Larven zu einer Färbung Block mit DW abzuwaschen das Essen. Ersetzen DW 6 mal. Dann mit M3 PS Medium zu ersetzen. Übertragen eines der Larven zu einer Färbung Block mit 2 ml M3 PS Medium. Unter einem Binokular, dissect eine larvalen Gehirn sorgfältig mit Standardmethoden 12, aber um eine Gewebebeschädigung zu minimieren, indem besondere Sorgfalt walten ausgehend in der folgenden Weise. Legen Sie die Larve dorsalen Seite nach oben und halten Sie die Dorsalseite bei einem Drittel von dem vorderen Ende mit 2 Paar Pinzette (einen in jeder Hand). Während Sie die vorderen Abschnitt, ziehen Sie das hintere Ende mit der Zange, und reißen die Epidermis. Das Gehirn und das VNC sichtbar sein soll von der hinteren Kante der vorderen Hälfte. Sorgfältig trennen das Gehirn und das VNC-Komplex durch Entfernen der fetten Körper, Darm und Epidermis. Wenn die VNCs zu stark beschädigt ist, wird die VNCs ganz oder teilweise degenerierten auch ohne stechende Verletzungen. Berücksichtigen Sie die folgenden Punkte: Ziehen oder reißen die Imaginalscheiben und peripheren Nerven aus dem Thorax VNC, da dies die VNC beschädigt wird. Um die peripheren Nerven geschnitten, halten die peripheren Nerven mit zwei Paar Pinzette nahe einander gelegt, und ziehen Sie dann die Nerven mit dem fürSteinpilze. Imaginalscheiben und Mund Teile links an der VNC werden. Lassen Sie den Ring Verschraubung und Lymphknoten an das Gehirn. Schneiden Sie das gut an dem Punkt am nächsten an das Gehirn, wo nicht viel Nahrung enthalten ist. Durch die Verwendung eines P20 Pipetman mit der Spitze abgeschnitten und weiteten sich ein wenig, übertragen Sie die VNC zu einer Färbung Block mit frischem M3 PS Medium. Bevor Sie die VNC, erste Pipette nach oben und unten nur das Medium für die Dissektion verwendet, um den VNC vom Kleben an der Spitze zu verhindern. 3. Stabbing Verletzung der Drosophila Larven VNC Dieser Abschnitt beschreibt, wie stechende Verletzungen der VNCs durchzuführen und erstochen-VNCs für Zeitraffer-Analyse und Immunfärbung vorzubereiten. Post-stechende Kulturbedingungen und Dauer werden in Abschnitt 5 (für Zeitraffer-Analyse) und in Abschnitt 6 (für Immunfärbung) beschrieben. Nach Zusammenlegung genug VNCs (4-5 für Zeitraffer-und über 24 für Immunfärbung), Transfer ein VNC auf eine saubere Färbung Block mit M3 PS. Richten Sie die VNC so dass die dorsale Neuropil ist im Hinblick unter dem Binokular (Abbildung 1B). Dies ist die natürliche Orientierung für VNCs in, wenn sie den optischen Loben angebracht liegen. Stab manuell mit einem Wolfram-Nadel unter die Dissektionsmikroskop, von dorsal nahezu im rechten Winkel und mit dem Ziel für die abdominale Hälfte des VNC (Abbildung 1B). Achten Sie besonders auf die folgenden: Stab nur einmal. Stab bis die Nadel trifft den Boden des Glases. Aber seien Sie vorsichtig nicht die Nadelspitze zu beschädigen. Der Stamm des Nadelhalters nicht berühren darf das Medium während Stechen. Die Wunde ist nicht unter der Dissektionsmikroskop sichtbar. Hinweis: Stab-Verletzungen unabhängigen Degeneration Das Verfahrenin Zelldegeneration innerhalb der VNC unterscheidet sich von der stechenden Läsion führen. Degeneration führt zu Löchern in der Neuropil und gelegentlich Löcher in der Rinde von nicht erstochen Proben beobachtet. Proben mit Degeneration, die die Neuropil oder verbreitet Degeneration beeinflussen auch die VNC Oberfläche muss verworfen werden. Degeneration kann wie folgt ermittelt werden: Raue Oberfläche, vor allem an der seitlichen / ventralen Bereich des Thorax, bei 22 h Stechen. In extremen Fällen sieht das VNC hervor. Löcher oder Vakuolen in der Brust Neuropil, die sichtbar sein als Löcher im Hintergrund Signal mit Fluoreszenz-Immunfärbung können. 4. Wartung von Nadel und Pinzette Prüfen Sie regelmäßig, ob die Nadelspitze scharf genug ist. Die Nadelspitze kann verbogen oder stumpf nachdem es ihn für einige Experimente. In diesem Fall, schärfen die Spitze mit einem Arkansas Stein oder gleichwertig. Die Spitzen der Zange musserfüllen perfekt. Die Spitzen können mit der Verwendung beschädigt werden. In diesem Fall stellen die Spitze mit einem Arkansas-Steine ​​oder gleichwertig. 5. Kultur und Zeitraffer-Aufnahme von Erstochen VNCs G9 – 13 – um das axonale Neuropil im lebenden VNC, ein GFP-Protein, das alle Trapline Axone markiert visualisieren kann verwendet werden, und um alle Gliazellen (außer der Mittellinie Glia) visualisieren die gliale Fahrer repoGAL4 verwendet werden können, um die UASdsRed exprimieren S197Y 14 Reporter. Durch Kreuzung G9 fliegt UASdsRedS197Y;; repoGAL4 Fliegen, VNCs von Nachkommen Larven werden mit grünen Axone und rot Gliazellen, die im lebenden Gewebe aufgenommen werden kann, erhalten. Nach Pooling 4-5 VNCs, Transfer 1 VNC auf eine saubere Färbung Block mit 2 ml M3 PS, und stechen die Bauch Hälfte des VNC, wie in Abschnitt 3. Übertragen Sie die erstochen VNC auf eine Poly-L-Lysin beschichteten 3,5 mm Glasboden Petrischale mit 1 ml M3PS. Legen Sie die VNCs dorsalen Seite nach unten. Schieben Sie die VNC mit der flachen Seite eines Pinzette, damit der VNC auf dem Teller kleben. Vorsichtig 1 ml M3 PS 15% FBS Rendern der endgültigen Konzentration von FBS auf 7,5%. Erwerben Sie Bilder mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Scannen Sie den VNC, Sammeln einer Z-Profil-Serie über seine gesamte Dicke. Wir verwendeten ein Leica SP2 invertierten konfokalen Mikroskops mit einem temperaturgeregelten Klimakammer. Einer äquivalenten konfokalen Mikroskop sollte funktionieren, aber es kann verlangen, Optimierung der Einstellungen für das Scannen. Die Einstellungen für unsere Zeitraffer-Konfokalmikroskopie waren wie folgt: Temperatur der Klimakammer: 25 ° C; 20X-Objektiv mit 4-fach Zoom, Scan-Modus xyzt mit 512×512 Pixel Auflösung, z = 1 um Schritte und 1-Stunde oder 2 – Stunden-Intervallen. Die Leica SP2 konfokalen Mikroskop hat eine Begrenzung der Dateigröße für das Scannen. Mit diesen Einstellungen können 8-9 Zeitpunkten abgetastet werden. Mitanderen konfokalen Mikroskopen, sollte es möglich sein, Bildstapeln für längere Zeit Punkte zu erwerben, dh über den Zeitraum von bis zu 24 Stunden. 6. Kultur und Immunfärbung von erstochen und behoben VNCs Bereiten Sie eine 24-Well-Zellkultur Platte mit 500 ul M3 PS 7,5% FBS pro Vertiefung. Wiederholen Dissektion von mehr als 24 VNCs für eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Durch die Verwendung des P20 Pipetman mit der Spitze abgeschnitten, übertragen 12 nicht erstochen VNCs aus dem Pool der Kulturschale mit 1 VNC pro Vertiefung. Stab der Rest VNCs im Pool wie in Kapitel 3 beschrieben. Übertragen Sie jede erstochen VNC zu einem gut jeder. Legen Sie die 24-Well-Platte in der 25 ° C-Inkubator für eine gewünschte Dauer je nach Experiment. Integrität der Zelle unverändert ist für mindestens 24 Stunden. Nach Kultur übertragen die 12 VNCs in 250 ul 4% Formaldehyd PEM in einer 1,5-ml-Tube mit dem P20 Pipetman mit der Spitze abgeschnitten. Dann wird die fixative wird vorsichtig aus, pipettiert dabei nicht um die VNCs beschädigen. Eine kleine Menge an Fixiermittel ausreicht, um die Proben abdecken sollte in jedem Rohr verbleiben. Anschließend fügen Sie frisches Fixativ, und sanft für 50 min bei RT rühren. Spülen 2 mal mit 0,3% Triton X PBS, und dann waschen 2 mal für 10 min mit 0,3% Triton X PBS bei RT. Block VNCs durch Inkubation mit 10% normalem Ziegenserum in 0,3% Triton X PBS für 1 h bei RT. Die Proben können bei 4 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. Inkubieren VNCs mit primären Antikörper für mehr als 20 Stunden bei 4 ° C. Spülen 2 mal mit 0,3% Triton X PBS, dann waschen 3 mal für 10 min mit 0,3% Triton X PBS bei RT. Inkubieren VNCs mit sekundärem Antikörper für mehr als 16 Stunden bei 4 ° C. Spülen 2 mal mit 0,3% Triton X PBS, dann waschen 3 mal für 10 min mit 0,3% Triton X PBS bei Raumtemperatur RT (im Dunkeln, wenn unter Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper). Ersetzen PBS mit 50% Glycerin 50% PBS für mindestens einStunde. Dann mit 80% Glycerin ersetzen: 20% PBS für mindestens eine Stunde. Montieren Sie einen VNC in einem Fenster auf 2 Lagen Cello-Band (ca. 0,06 mm) auf einem Mikroskopie Objektträger aus Glas gemacht. Passen Sie die Ausrichtung, und legen Sie eine Deckglas (18×18 mm) über dem Fenster. Zwei VNCs kann auf einer Folie mit dieser Methode angebracht sein. Mit einer Vielzahl von primären Antikörpern, um Verletzungen zu verschiedenen zellulären Reaktionen analysiert werden (z. B. Änderungen der Zellzahl und Zellform) werden. 7. Analysieren von Daten mit ImageJ und eine Reihe von Plugins Wenn der VNC keinen stechenden unabhängigen Degeneration, muss die Probe in der Analyse unabhängig von Größe der Läsion gezählt werden. Als stechende manuell durchgeführt wird, unterscheidet sich die Größe der Läsion jeder Zeit. Somit ist es wichtig, eine statistische Analyse der Wirkung stechend, wann immer möglich. Wundgröße Messung. Die Größe der Wunde ist ein Indikator für Reparatur 15.Der stechende Läsion sichtbar ist frei von GFP-Expression. Läsion Bereich kann lapse Daten über frei verfügbare ImageJ-Software gemessen werden, wie folgt: Mit ImageJ, öffnen Sie einen Stapel der konfokalen Bilder von "File"-Menü wählen Sie "Import" und wählen Sie hier "Image-Sequenz". Dadurch wird die Ansammlung von einzelnen Bildern in einem Stapel drehen. Weiter ändern Sie die "Stack" in einen "HyperStack", indem Sie auf "Image" Menü "HyperStack", und wählen Sie dann "Stapel zu HyperStack". Stellen Sie die Voxelgröße mit "Eigenschaften" aus Menü "Bild". Im gewonnenen Daten unter Verwendung des konfokalen Mikroskops Leica SP2 kann der Voxelgröße vom Scanning-Software erhalten werden, und aus den Metadaten Textdatei zusammen mit Bildern gespeichert. Mit unserer Einstellung, wie in Abschnitt 3 beschrieben, sind Pixelmaße xy = 0,366211 um und z = 0,99709 um. Durch die Untersuchung alle Scheiben in einem Zeitpunkt, ziehen Sie die maximale Kontur der Läsion mit dem Polygon-Werkzeug in der Werkzeugleiste. Dies ist derRegion Of Interest (ROI). Fügen Sie den ROI der ROI-Manager, indem Sie auf "Analyze"-Menü, scrollen Sie nach unten und wählen Sie "Extras", dann "ROI-Manager", dann auf "Hinzufügen". Wiederholen Sie diesen Vorgang für die alle Zeitpunkte. Klicken Sie auf das "Measure"-Button in der ROI-Manager, um den Bereich Größe der einzelnen ROI zu erzielen. Korrektur der VNC Bewegung während Zeitraffer-Aufnahmen. "Stackreg" und "Turboreg" plugins 16 (aus dem ImageJ Website http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): Diese Plugins ermöglichen kleine Probe Bewegungen während Zeitraffer korrigieren. Bauen Sie einen Stapel mit einem gleichwertigen Vertreter optischer Schnitt durch alle Zeit-Punkten und wendet die Plugins. Es hilft, wie die Läsion Veränderungen im Laufe der Zeit zu visualisieren. Die Details zu diesen Methoden und die Bedienungsanleitung sind von der Arbeitsgruppe, die diese Plugins entwickelt. ( http://bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg /). Automatische Zählung von Gliazellen. "DeadEasy Glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): Diese wurde entwickelt, um die Anzahl der REPO-positive Gliazellen im Drosophila Larven VNC zu zählen und die Veränderung der Gliazellen zu untersuchen Zahl durch stechende Verletzungen 17 verursacht. Das Plug-in arbeitet präzise, ​​mit einem Fehler von 0,1% falsch-positiven und falsch-negativen 4,3% 17. So verwenden Sie dieses Plug-in, first-Label alle Glia (außer der Mittellinie) in der Probe mittels Immunfluoreszenz mit anti-REPO Antikörper. Dann installieren Sie das Plug-in in ImageJ, öffnen Sie einen Stapel von konfokalen Bildern und Plug-in. Es zählt Gliazellen automatisch in etwa 30 Sekunden. Automatisches Zählen von apoptotischen Zellen. "DeadEasy Caspase Larven" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Dieses wurde entwickelt, um die Anzahl der Zellen mit anti-gespalten Caspase3-markiertem zu zählen, und eine neue Version wurde für die Larven VNCs angepasst. Stechende Schädigung bewirkt eine Erhöhung der programmierten Zelltod 11. So verwenden Sie dieses Plug-in, first-Label apoptotischen Zellen in der Probe mittels Immunfluoreszenz mit anti-gespaltenen-Caspase-3-Antikörper. Dann installieren Sie das Plug-in in ImageJ, öffnen Sie einen Stapel von konfokalen Bildern und Plug-in. Es zählt apoptotischen Zellen automatisch in etwa 30 Sekunden. 8. Reagenzien Kulturmedium: Schild und Sang M3 Insektenmedium, 7,5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1%. 0,01% Poly-L-Lysin in sterilem DW. Fixative: 4% Formaldehyd, Reinstwasser in PEM (0,1 M PIPES, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4) Lösung. Blocking Lösung für Immunfärbung: 10% normalem Ziegenserum in 0,3% Triton X PBS. Anti-Glutamin Synthetase2-Antikörper: 1:250 in Blocking-Lösung. Anti-GFP-Antikörper: 1:1.000 in Blockierungslösung. Anti-REPO Antikörper: 1:250 in Blocking-Lösung. Anti-ELAV Antikörper: 1:250 in Blocking-Lösung. Anti-gespaltenen Caspase 3 Antikörper: 1:1000 in Blocking-Lösung. Sekundärantikörper: 1:250 in Blocking-Lösung.