CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)
Summary
CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.
Abstract
Genom düzenleme gen fonksiyonu ve hastalığın genetik temeli aydınlatmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. DNA dizilerinin kimyasal tabanlı mutajenez veya rasgele entegrasyonu gibi düzenleme yöntemleri Geleneksel gen genel verimsiz biçimde gelişigüzel genetik değişiklikler görüşmek ve istenmeyen sentetik dizilerinin kuruluş gerektiren veya potansiyel biyolojik çalışmada kafa karıştırıcı, sapkın kültür koşullarının kullanın. Buna karşılık, bir hücreye geçici ZFN ifadesi, hassas kolaylaştırabilir transgenlerin sentetik kimyasalların veya entegrasyon yönetimi için gerek kalmadan çok etkili bir şekilde gen düzenleme kalıtsal.
Çinko parmak nükleazlar (ZFNs) çift iplikli DNA (dsDNA), belirgin dizileri bağlanır ve kesilir enzimlerdir. Fonksiyonel bir CompoZr ZFN ünitesi yaklaşık 15-18 nükleotidlerin bir DNA "yarı-site" bağlamak iki ayrı monomerik proteinleri (bkz. Şekil 1) oluşur. Ne zaman iki ZFN monoDNA bölünme etki dimerize ve DNA çift iplikli sonu (DSB). genomunda ZFN aracılı DSBs 1 Giriş yüksek verimli genom düzenleme için bir temel atar oluşturmak onların bitişik hedef sitelerine mers "ev". Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) DNA tamir yolu ile bir hücrede DSBs kusurlu onarım küçük eklemeler ve silmeler (indellerin) neden olabilir. Bu protokolün bir gen eleme oluşturmak için ZFNs kullanımı, transgenlerin entegrasyonu tarif ederken, bir hücrenin geninin kodlayıcı dizisinin içinde indellerin yaratılması da vasıtasıyla yapılabilir frameshift ve yüksek verimle bir gen yerinin. 2 müteakip işlevsel eleme sonuçlanabilir ZFN kesim yerinde homoloji-yönettiği onarım.
CompoZr Özel ZFN Servis ZFN teknoloji ile bilimsel topluluk için hedeflenen gen düzenleme için, sistematik, kapsamlı ve iyi karakterize bir yaklaşımı temsil ediyor. Sigma bilim adamları) 1 araştırmacılar ile yakın çalışmak perfoproje hedefleri, 2 uyarınca ilgili gen yapısı, biyoloji ve model sistem analizi) dahil olmak üzere rm özeni analizi daha sonra tasarım, inşa ve işlevsel ilgili bir faaliyet için ZFNs doğrulamak) bir ses hedeflemesi, 3 geliştirmek için bu bilgiyi uygulama hücre hattı. Araştırmacı pozitif kontrol genomik DNA ve astar alır ve plazmid DNA hem de hem de in-vitro transkripsiyon mRNA formatında verilen ZFN reaktifler hazır kullanın. Bu reaktifler sonra araştırıcı hücre hattı veya tercih hücre tipi geçici ifadesi için teslim edilebilir. Örnekler daha sonra, PCR, enzimatik özet ve elektroforez gibi standart moleküler biyoloji teknikleri ile ilgi odağı az gen düzenleme için test edilmektedir. Gen düzenleme için olumlu bir sinyal ilk nüfus tespit edildikten sonra, hücreler klonlanmış tek hücreli ve mutant klonlar / alel belirlenmesi için genotipleme vardır.
Protocol
Discussion
Bir kez ZFN modifiye hücreleri bunlar kalıcı olması ve DNA değişiklikler kalıtsal izole edilmiştir. Araştırma yapmak için istenilen genetik değişiklikler ile stabil bir şekilde değiştirilmiş hücre hatları veya ırk hayvanlar oluşturma yeteneği ile sonuçlanır. CompoZr Özel ZFNs genom hücre tipleri çok çeşitli düzenleme için sağlam bir yöntem sağlar. ZFNs ile düzenleme başarılı genomunun Yayın oluşturmak için yeteneği vardır ama insan hücre hatları, fare, sıçan, Zebra balığı, kurbağa, domuz ve CHO araştırma modelleri ile sınırlı değildir. 3,4,5,6,7,8,9 ZFNs düzgün bir hücreye ulaştığında Belirtilen hücre tipinde istenen hedef yerinde çift sarmallı mola sağlanır. Bir hücrenin içinde birden fazla genetik modifikasyon sahip olmak için bir hücreye sıralı çinko parmak değişiklikler yapmak da mümkün. 10 belirli bir hedef sırası seçin ve yalnızca o belirli odağı birden yaratma yeteneği için birincil nedenidir değiştirme yeteneği modifikatyonlar.
Analiz CompoZr Özel ZFN belgesi böylece kiti tüm bileşenleri iyice müşteri başarı için onaylanmıştır güvence altına kiti sağlanan çok reaktifleri ile oluşturulur. Başından sonuna kadar, iş akışının önemli adımlar aşağıda sunulmuştur:
Hücre klonlama
Belirli bir hücre hattı izole etmek ve genişletmek için yeteneği herhangi bir ZFN deneyler başlamadan önce test edilmelidir. Tek hücreleri izole edilmiş ve bir klon-türevi nüfusu mümkün olduğundan emin olmak için genişletilmiş edilmelidir. Bazı hücre hatları bu konuda inatçı, ve bu şartlı medya ile düzenlenmiş klonlar için zenginleştirme, ya da kültür gibi hileler bu zorlukları aşmak için yardımcı olabilir.
Uygulama randımanına
Teslimat verimlilik Optimizasyonu ZFNs tesliminden önce bir zorunluluktur. Pek çok yöntem lipid bazlı transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofecti dahil olmak üzere kullanılabileceküzerinde. İdeal dağıtım yöntemi uygulama randımanına ve hücre canlılığı en optimal bir karışım elde edildi oluşur. Bu verimlilikler miktarlarının görsel denetim veya FACS 24-48hrs teslimat sonrası bir GFP kontrolü plazmid ve miktarlarının sunarak tahmin edilebilir.
Cel-I testi
Bu Cel-I PCR testi, sindirim ve elektroforezi parametreleri ZFN deneyi yorumlanması engel olmayacak emin olmak için uygun kontrollerin paralel olarak yapılır şarttır. Her kit analiz sertifikası Cel-I görüntü oluşturmak için kullanılan kontrolü genomik DNA içerir. Cel-I testi ile takip sağlanan primer ile kontrol DNA Amplifikasyon kullanıcı Analiz Sertifikası (CofA) görüntü kaydıyla birlikte sonuçları karşılaştırmak için, izin ve bir deneme bu açıdan herhangi bir potansiyel verimsizlik izole olacaktır. Böyle bir sahte veya GFP gibi uygun bir negatif kontrol hücre muameleÖrnek aynı zamanda herhangi bir spesifik olmayan parçalanma ürünleri ile aydınlatılması izin verilmelidir.
Tek hücreli klon Nicel / nitel analizi
ZFN tedavisi ve tek bir hücre Klonlamadan sonra, hücrelerin popülasyonlarının bir dizi yöntem ile, ilgilenilen loküsündeki düzenleme bakımından uygun şekilde taranabilmektedir. Cel-I tayini daha genotipleme için aday klonlar belirlenmesi amacıyla klonlar genomik DNA üzerinde yapılabilir. Bu, bir uygulamadan önce 1:01 oranında Örnek amplikonlar içine spike WT PCR amplikon önemlidir Cel-I homozigot mutant molekülleri klonlar homojen içerecek şekilde sindirilmesi, ve böylece bir negatif Cel-I test sonucu iletir. Bu aday klonlar taranması için alternatif bir yöntem doğrudan ZFN hedef site üzerinde bir PCR primer iniş tasarlamaktır. Kontrol primerler biri ile birlikte kullanılan bir negatif assay sonucu WT sekansı kaybına göstermektedir. En az bir WT alel içeren bir heterozigot klonu y olacaktırield PCR sinyali, fakat SYBR qPCR bağlamında PCR yapılarak tamamen WT klonlar ayrılacaktır olabilir.
Aday klonlar yukarıdaki yöntemleri ile tespit edilmiş olan bir kez, standart pyrosequencing, derin sekans, ya da diğer yöntemler ile sekans genotyped edilebilir. Tüm sekanslama için yöntemlerle, klonal genomik DNA oluşturulan bir amplikon oluşturulan edilmelidir. Geleneksel pyrosequencing allelleri için TA-klonlama PCR ürünü ile ayrı ve tek tek koloniler sıralama olabilir. Derin bu adımı sıralama gibi yöntemler için gerekli değildir.
Homoloji Yönetmen Onarım (HDR)
Bu protokol, NHEJ yoluyla ZFN aracılı gen boşaltma için bir yöntem sağlar. Transgenlerin entegrasyonu da kanadında bir kesim ZFN sitesi. 11. Bu senaryoda, ZFN çift sarmallı mola HDR yerine NHEJ ile tamir edilir oluşturduğunuz homoloji silah ile plazmid bir donör tanıtımı tarafından yapılabilir. HDR i yönettitransgenlerin of ntegration bu protokol içinde yer alan prosedürlere benzer yöntemlerle teyit edilebilir.
Sorun Giderme
ZFNs teslim
ZFN teslimat ve ifade teslim bir GFP veya diğer görselleştirme ve / veya kantitatif için plazmid gibi. Teslimi ile de kontrol edilebilir Ilgi ile hücre tipi organizatörü uyumsuzluğu nedeniyle Düşük ifade mRNA formatında ZFNs teslimi ile çözmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, soğuk şok yöntem ayrıca hücreleri ZFNs etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. 12 mRNA kullanılması durumunda bu hücreler her serum kaynaklı Rnases çıkarıldı sağlamak için gerçekleştirilmesinden önce yıkanıp şarttır. Bu buz üzerinde mRNA çözülme ve bozulmanın için herhangi bir şansı en aza indirmek için son anda hücrelere eklemek için de isabetli olmuştur.
Cel-I testi
Cel-I assa temeliy ilgi odağı belirli ve geniş amplifikasyon olduğunu. Non-spesifik amplifikasyon ürünleri gözlenmesi halinde bu şablonu miktarı optimizasyonu, astar konsantrasyon, ve bisiklet parametre olarak özgüllüğü artırmak için standart PCR sorun giderme yordamları kullanın. Ikinci yöntemi yeterli çözünürlük ve hassasiyet sağlamaz gibi standart agaroz elektroforez aksine PAGE analizi yapın. Herhangi sindirilmiş ürünü ya da aşırı bulaşması görülmektedir halinde Cel-I özeti koşulları da optimize edilebilir. Cel-1 nükleaz ve / veya sindirim süresi yeterli uzunluktaki bir miktarının titrasyonu bu yönleri iyileştirmek için titre edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
| GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Kim, Y. G. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).
- Urnov, F. D. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Meyer, M. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).
- Geurts, A. M. Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Meng, X. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).
- Young, J. J. Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Wanatabe, M. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).
- Santiago, Y. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Lui, P. Q. Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Doyon, Y. Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption. Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).
