CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

1。カスタムZFNのデザインプロセス ZFN設計プロセスを促進するために、研究者は提供する必要があります。 そのような遺伝子名、種、遺伝子アノテーション/識別番号などの標的遺伝子についての情報。 実験の明記オーバーすべての目的（例えば、ノックアウトまたはノック） 非定型の遺伝子構造、遺伝子座に関与する特殊な生物学、または他のゲノム内の任意の相同性領域を含む遺伝子ターゲットの特定の要因。 ジンクフィンガーのDNA配列の特定の範囲が対象とするヌクレアーゼ。 シグマバイオインフォマティクスチームは最初のジンクフィンガーターゲットサイトを開発するシリコZFNのデザインで実施しています。 初期ZFNの標的部位は、ZFN科学技術コンサルタントに提供されます。もっと技術的に複雑なプロジェクトでは、このシグマの科学者は、プロジェクトの戦略を開発する研究者で動作します。 <lI>シグマバイオインフォマティクスチームでは、シリコZFNのデザインに生成するためにZFNのアルゴリズムで解析を行っています。これにより、オフターゲットサイト、繰り返しマスキング、各潜在的なZFNターゲットサイトのSNP解析のための全ゲノム検索を含まれています。 バイオインフォマティクスは、レビューのために調査官にトップZFNの標的部位を提供します。潜在的なZFNの標的部位の承認を得て、この情報はZFN製造プロセスを開始するZFN制作チームに提供されています。 2。カスタムZFN生産ジンクフィンガーモジュールのシグマ·アーカイブが承認されたZFNのデザインを組み立てるために使用されます。 各ZFNのデザインは組み立て順序は、ハイスループットクローニングプラットフォーム上で検証されます。 一度すべてのZFN設計の生産は、検証に送信されるすべてのZFNを完了しています。 3。カスタムZFNsの検証 ZFNプロジェクトのヒト、マウス、ラットまたはCHO種それぞれの種に対して、十分に特徴付け細胞株で検証され、酵母ベースのアッセイは、他の生物や細胞の種類に使用されます。 ZFNコンストラクトはヌクレオことによって、適切な細胞株に配信され、ZFNsが表現されています。 DNAはZFNトランスフェクトした細胞のプールから収穫され、関心のある領域をPCR増幅されます。 CEL-1アッセイは、その後のPCR産物で実施されています。ゲル電気泳動を検証ZFN活動にCEL-1アッセイ上で実行されます。 CEL-1アッセイによって確認され、最高の活性ZFNのデザインは、顧客に提供されます。 ZFNsは、ポジティブコントロールとしてCEL-1アッセイとゲノムDNAのPCRプライマーと一緒にmRNAおよびプラスミドDNAで配信されます。 4。ヌクレオによって検証ZFNsの配信 2×10 5細胞/ mlヌクレオ前日の密度で種の細胞を。 ヌクレオの日に、セルラインのNucleofectorキットVを取り出し、室温にしましょう​​。 製造元のプロトコールに従ってVヌクレオソリューションに補足を追加します。 細胞をカウントします。細胞密度は2.5×10 5細胞/ mlの間でなければなりません。 前のヌクレオに少なくとも20分間37℃CO 2インキュベーター内で各ウェルにあらかじめ暖かい媒体の2ミリリットルを6ウェルプレートを埋める。 5分間200xgでトランスフェクション当たり2×10 6個の細胞（8×6の合計）を遠心します。 ハンクス平衡塩溶液（HBSS）20 mlで2回細胞を洗浄します。 実験的なチューブを準備します（カスタムZFN技術情報で表を参照してください） インキュベーターからのステップ（6.5）からメディアを含む6ウェルプレートを取り外します。 ヌクレオソリューションの400μlの再懸濁し（100μL/反応）V. 一度反応は、それぞれのDNAまたはmRNAを含むチューブに細胞100μlを追加します。 TRANSFER適切なプログラムでのNucleofectorで2ミリメートルエレクトロポレーションキュベットとnucleofectの混合物。 すぐに各サンプルのヌクレオした後、キュベットにステップで6ウェルプレート（6.9）から温め媒体の〜500μlを追加するには、ピペットを使用しています。その後、慎重に6ウェルプレート内の残りの温めておいた培地にキュベットから細胞を転送します。 すべての反応を終了し、37℃CO 2インキュベーターに6ウェルプレートを返す 5。 ZFNsの配信後、ゲノムDNAを採取する 6ウェルプレート – プールされたすべてのセルを収穫しないでください。それはあなたがCEL-1消化製品を持っていることを確認した後単一細胞希釈クローンの細胞を持つために、文化を維持することが重要です。 1〜3日後のヌクレオGenElute哺乳類のゲノムDNAミニプレップキットを使用して染色体DNAを調製するために細胞を収集します。 6。 CEL-1アッセイ</P> PCRは、付属のプライマーを用いて、ZFNトランスフェクションサンプルとキットに付属の陽性対照ゲノムDNAからゲノムDNAを増幅する。 （カスタムZFN技術情報で表を参照）：PCR反応は以下の条件で設定されています。 PCRのhomoduplexesからヘテロを生成するには、それぞれのZFN処理したサンプルに加え、コントロールからのPCR反応液10μlを取り、サーモサイクラー上で次のプログラムを使用します。 95°C、10分 95°C〜85°C、-2°C /秒 85°C〜25°C、-0.1°C /秒 4°C、無期限に 42各反応とインキュベート°C 20〜40分のためにエンハンサー、1μlとヌクレアーゼS 1μlを（Transgenomicカタログ番号706025）を追加。 そのようなDirectLoad WideRange DNAラダー（製品番号D7058）のような適切なマーカー（カスタムZFN技術的セキュリティ情報の結果を参照してください）​​、10％PAGE-TBEゲル上で消化を実行します。 上のCE正の信号がCEL-IアッセイによりZFN処理集団で検出された、クローンの単離および特性評価に進みます。 7。クローンの単離とキャラクタリゼーション FACSおよび希釈クローニングを含む標準的な方法により単一細胞クローンZFN処理したサンプル。 クローンバンクの材料として残りをバック凍結、ゲノムDNAの収穫のための細胞のいくつかの割合を分割して、十分に拡張することができます。 CEL-Iプライマーを用いたクローンからゲノムDNAを増幅し、CEL-Iアッセイ（にスパイクWT DNAの有無にかかわらず）によりアンプリコンを分析し、あるいは遺伝子型に直接進むために、このアンプリコンを使用しています。 遺伝子候補クローンが好ましい方法で編集された対立遺伝子を有するものとして同定した。 8。代表的な結果全体CompoZr ZFNワークフローの例を図2に示されています。 ZFNsが配信されます彼らは二本鎖切断（DSB）を作成し、適切なDNA配列に結合し、切断する細胞に。自然の修復プロセスは、非相同末端接合（NHEJ）、修理DSB。ヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいくつかのインスタンスで異常なNHEJの結果。 PCR反応の変性/アニーリングステップの後に野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成に収穫されたゲノムDNAの結果のPCR増幅。任意のヘテロ分子の開裂にCEL-1酵素の添加により。 CEL-1の結果は、ZFN切断を確認するためにPAGE分析によって解決されます。 図3は、CEL-1アッセイと期待される結果の概略を提供しています。 代表的なCEL-1の結果は、 図4および図5に含まれている図4は、K562細胞におけるZFNs（21％）の非常にアクティブなペアから結果が含まれています。 図5は、ZFNsの少ないアクティブペア（2.4％）からの結果が含まれていますK562細胞。 ZFN活性は、親のPCR断片を、以下の2つのPCR断片の存在によって、両方の数字で確認されています。 図1。バインドされたジンクフィンガーヌクレアーゼの表現。ZFNsはFokI制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合ジンクフィンガーDNA結合ドメインから成る組み換えタンパク質である。ヘテロ二量体として結合すると、ZFNsは、ユーザーが指定したDNA配列において二本鎖ブレークを作成します。 図2。カスタムZFNサービスワークフローの概略図。CompoZrのZFNsを使用して、遺伝子組換え細胞株を生成するためのワークフローのグラフィック表現。 図3。 CEL-1アッセイと結果の概略）。ZFNプラスミドO R mRNAは、細胞に送達されています。 B）ZFNsバインドを発現し、細胞の部分の二本鎖切断（DSB）を作成し、その標的配列を切断。 C）非相同によっていくつかのDSBの異常修復がヌクレオチド挿入または欠失で結果を結合し終了します。 D）ゲノムDNAは、細胞のトランスフェクトされたプールから収穫し、興味のある遺伝子座で増幅されています。 EF）PCR産物を変性し、野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成を作成して再アニール。 G）ヘテロ分子の開裂にCEL-1の不一致エンドヌクレアーゼアッセイの結果。 H）CEL-1酵素のダイジェストは、PAGEによって解決されます。経口バンドの切断産物の観察率は、ImageJのソフトウェアによって決まり、ZFNsの端数カットと効率性を示しています。 図4。 21パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは、で確認できます。_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/。 図5。 2.4パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは次のURLで入手できます。。 http://rsbweb.nih.gov/ij/ 。