הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

1. תהליך עיצוב מותאם אישית ZFN כדי לזרז את תהליך התכנון ZFN, החוקר צריך לספק: מידע על הגן היעד כגון שם גנים, מינים, וכן ביאור / מספר זיהוי הגן. בבירור מעל כל מטרת הניסוי (למשל, נוק או הפיל) כל הגורמים הספציפיים של היעד הגן הכוללים מבנה הגן טיפוסית, ביולוגיה מיוחד מעורב לוקוס גנטי, או כל מקום אחר הומולוגיים אזורים בגנום. טווח מסוים של רצף ה-DNA של אצבע אבץ nucleases להתמקד. צוות ביואינפורמטיקה Sigma עורכת בעיצוב ZFN סיליקו לפתח הראשונים אצבע אבץ אתרי היעד. היעד הראשוני אתרים ZFN ניתנים יועץ ZFN טכנית מדעית. עבור פרויקטים מורכבים יותר מבחינה טכנית, זה מדען Sigma עובד עם החוקרים לפתח אסטרטגיית הפרויקט. <lאני> צוות ביואינפורמטיקה Sigma מבצעת ניתוח עם אלגוריתמים ZFN ליצור בעיצובים סיליקו ZFN. זה כולל חיפוש הגנום כולו מחוץ היעד אתרים, מיסוך חוזר, וניתוח SNP עבור כל אתר ZFN פוטנציאל היעד. אינפורמטיקה מספקת היעד האתרים המובילים ZFN לחוקר לבדיקה. עם אישור של אתרי מטרה פוטנציאליים ZFN, מידע זה מסופק צוות הפקה ZFN כדי להתחיל את תהליך הייצור ZFN. 2. הייצור מותאם אישית ZFN ארכיון סיגמא של מודולים אצבע אבץ משמש כדי להרכיב את העיצובים ZFN מאושרות. עיצוב כל ZFN מורכב ורצף אומת על פלטפורמה תפוקה גבוהה שיבוט. לאחר הייצור של כל העיצובים ZFN הוא להשלים את כל ZFN נשלח אימות. 3. אימות של ZFNs אישית ZFN פרויקטיםהמין האנושי, עכבר, חולדה או CHO מאומתים על שורות תאים שאפיינו גם עבור כל מין, assay המבוסס על שמרים משמש אורגניזמים אחרים או סוגי תאים. בונה ZFN מועברים לתוך קו התא המתאים ידי nucleofection ואת ZFNs באים לידי ביטוי. ה-DNA נאסף מתוך מאגר של תאים ZFN transfected והאזור עניין מוגבר PCR. Assay-1 CEL מתנהל ואילך מוצר ה-PCR. ג'ל אלקטרופורזה מנוהלת על assay cel-1 לפעילות ZFN תוקף. ZFN הגבוהה ביותר בפעילות העיצוב כמו אושר על ידי assay cel-1 מסופק מכן ללקוח. ZFNs מועברות ב-mRNA ו-DNA פלסמיד יחד עם primers ה-PCR עבור assay cel-1 ו-DNA הגנומי כביקורת חיובית. 4. מסירת ZFNs מאומת על ידי Nucleofection זרע התאים בצפיפות של 2×10 5 תאים למ"ל יום לפני nucleofection. ביום nucleofection,להוציא את קו סלולרי Nucleofector ערכת V ולתת חם לטמפרטורת החדר. מוסיפים את תוספת הפתרון Nucleofection V לפי הפרוטוקול של היצרן. לספור את התאים. צפיפות התאים צריך להיות בין 2.5-5×10 5 תאים למ"ל. מלאו צלחת 6-היטב עם 2ml של המדיום בכל היטב מראש חם CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני nucleofection. סרכזת 2×10 6 תאים לכל transfection (6 בסך הכל 8×10) בשעה 200xg במשך 5 דקות. לשטוף את התאים פעמיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). הכינו צינורות הניסוי: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN) הסר את הצלחת היטב המכיל 6-Media משלב (6.5) מתוך האינקובטור. Resuspend תאים μl 400 (100 μl / התגובה) של פתרון Nucleofection V. תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים ל-DNA או כל mRNA המכיל צינור. Transfאה את התערובת ל 2 מ"מ electroporation קובט ו nucleofect על Nucleofector עם תוכנית מתאימה. מיד לאחר nucleofection של מדגם זה, השתמש פיפטה העברת להוסיף ~ 500 μl של המדיום prewarmed מהצלחת 6-גם בשלב (6.9) כדי קובט. ואז, בזהירות להעביר תאים קובט עד בינוני prewarmed שנותר בצלחת 6 היטב. לסיים את כל התגובות ולהחזיר את צלחת 6-היטב CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. 5. קציר הדנ"א הגנומי לאחר מסירת ZFNs 6 גם בצלחת – לא לקצור את כל התאים אספו. חשוב לשמור על תרבות כדי שיהיה תאים לשבט תא בודד דילול לאחר שתוודא כי יש לך מוצרים cel-1 עיכול. אחד עד שלושה ימים לאחר nucleofection לאסוף את התאים כדי להכין את ה-DNA כרומוזומלי באמצעות DNA GenElute היונקים הגנום ערכת Miniprep. 6. Cel-1 Assay </p> PCR להגביר את הדנ"א הגנומי מן דגימות transfected ZFN והשליטה חיובית דנ"א גנומי המסופק בערכה, באמצעות primers המצורף. תגובת PCR מוגדר עם התנאים הבאים: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN). כדי ליצור heteroduplexes מן homoduplexes ה-PCR לקחת 10 μl של תגובה PCR מכל מדגם ZFN לטפל בתוספת מלאה להשתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 95 מעלות צלזיוס, 10 דקות 95 ° C עד 85 ° C, -2 ° C / 2 85 ° C עד 25 ° C, -0.1 ° C / 2 4 ° C, ללא הגבלת זמן הוסף 1 μl של משפר ו 1 μl של nuclease S (מ מס 'קטלוגי Transgenomic 706025) לתגובה כל דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 20-40 דקות. הפעל את digestions על ג'ל עמוד TBE 10% עם סמנים מתאימים, כגון סולם WideRange DNA DirectLoad (מק"ט D7058) (ראה תוצאות עלון מותאם אישית טכנית ZFN). עלאיתות חיובי לספירה זוהה ZFN שטופלו על ידי אוכלוסיות assay cel-I, המשך בידוד ואפיון משובט ו. 7. בידוד אפיון משובט ו מתא בודד לשבט את ZFN שטופלו דגימות בשיטות סטנדרטיות כולל FACS ו שיבוט דילול. אפשר המשובטים להרחיב במידה מספקת, ואז לפצל חלק חלקם של התאים לקציר הדנ"א הגנומי, הקפאת בחזרה את יתרת חומר הפקידה. להגביר את הדנ"א הגנומי מן שיבוטים באמצעות cel-I primers ולנתח amplicon ידי assay cel-I (עם או בלי ה-DNA WT זינק ב), או לחילופין להשתמש amplicon להמשיך ישירות genotyping. המועמד שיבוטים גנוטיפ מזוהה כבעל אללים בעריכת השיטה המועדפת. 8. נציג תוצאות דוגמה כולו CompoZr ZFN העבודה מוצגת באיור 2. ZFNs מועברותלתאים שם נקלטות ודבק את רצף ה-DNA המתאים היוצרת הפסקה פעמיים תקועים (DSB). תהליך התיקון הטבעי, שאינם הומולוגיים בסופו של דבר להצטרף (NHEJ), תיקון DSB. בכמה מקרים חריגים תוצאות NHEJ ב הכניסה מחיקה או החלפה של נוקלאוטידים. PCR הגברה של שנקטפו תוצאות הדנ"א הגנומי במבנה heteroduplex בין סוג פראי amplicons להשתנות אחרי denaturation / צעד חישול התגובה PCR. תוספת של cel-1 תוצאות האנזים המחשוף של כל מולקולות heteroduplex. Cel-1 תוצאות נפתרים על ידי ניתוח עמוד לאשר מחשוף ZFN. איור 3 מספק סכימטי של assay cel-1 ואת התוצאות הצפויות. נציג cel-1 תוצאות כלולים איורים 4 ו -5 איור 4 מכיל תוצאות זוג פעיל מאוד ZFNs (21%) ב K562 תאים,. איור 5 מכיל תוצאות זוג פחות פעילים (2.4%) של ZFNs בK562 תאים. פעילות ZFN הוא אישר דמויות הן על ידי נוכחות של שני קטעי ה-PCR מתחת שבר PCR ההורים. באיור 1. ZFNs ייצוג nucleases אצבע קשורות אבץ. מתוכננים חלבונים המורכבים אצבע אבץ DNA-binding תחום התמזגו לתחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI. כאשר קשורים כמו heterodimer, ZFNs ליצור הפסקה פעמיים תקועים על רצף DNA מסוים המשתמש. איור 2. סכמטי של זרימת עבודה מותאמים אישית ZFN שירות. ייצוג גרפי של זרימת עבודה כדי ליצור קו תאים מהונדסים גנטית באמצעות ZFNs CompoZr. איור 3. סכמטי של assay cel-1 ואת התוצאות.) ZFN o פלסמיד mRNA R מועבר לתאים. ב) הביעו לאגד ZFNs וחותכים רצף היעד שלהם ליצור הפסקה גדילי כפול (DSB) בחלק של תאים. ג) תיקון החריג של DSBs מסוימים על ידי אי – שהצטרף בסופו של הומולוגיים התוצאות הכניסה נוקלאוטיד או מחיקה. D) הדנ"א הגנומי נאסף ממאגר transfected של תאים מוגבר על מוקד של עניין. EF) PCR המוצר הוא מפוגל מחדש מרותק יצירת היווצרות heteroduplex בין סוג פראי amplicons שונה. ז) cel-1 endonuclease אי התאמה ב assay תוצאות המחשוף של מולקולות heteroduplex. ע) cel-1 אנזים מעכל נפתרות על ידי. היחס הנצפה של המוצר מחשוף ללהקה Parenteral, נקבע על ידי ImageJ תוכנה, מציין לחתוך חלק והיעילות של ZFNs את. באיור 4. Cel-1 נובע ZFNs פעילים 21% התוכנה ImageJ זמין בכתובת:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. איור 5. Cel-1 נובע% 2.4 ZFNs פעילים ImageJ התוכנה ניתן למצוא באתר:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .