Genome Editing con nucleasi zinco Finger CompoZr personalizzati (ZFNs)

1. Personalizzato ZFN Process Design Per accelerare il processo di ZFN design, un investigatore dovrebbe fornire: Informazioni sul gene bersaglio come il nome del gene, specie, e gene annotazione / numero di identificazione. Un chiaramente over-all obiettivo dell'esperimento (ad esempio, Knockout o Knockin) Eventuali fattori specifici del gene bersaglio che comprendono struttura atipica gene, biologia speciale implicato nel locus genetico, o qualsiasi regioni omologhe in altre regioni del genoma. La gamma specifica di sequenza di DNA per il dito di zinco nucleasi di destinazione. La squadra Sigma bioinformatica conduce nel design silico ZFN di sviluppare iniziali di zinco siti bersaglio delle dita. Iniziali siti bersaglio ZFN sono prestati ad una ZFN consulente scientifico tecnico. Per i progetti tecnicamente più complessi, questo scienziato Sigma collabora con gli inquirenti per sviluppare la strategia del progetto. <li> La squadra Sigma bioinformatica effettua una prima analisi con algoritmi ZFN per generare in silico design ZFN. Questo include un intero genoma per la ricerca off-bersaglio siti, mascheramento ripetizione, e l'analisi SNP per ogni sito potenziale bersaglio ZFN. Bioinformatica fornisce i migliori siti bersaglio ZFN al ricercatore per la revisione. Dopo l'approvazione dei siti potenziali destinatari ZFN, questa informazione viene fornita al team di produzione ZFN per iniziare il processo di fabbricazione ZFN. 2. Personalizzato ZFN Produzione L'archivio dei moduli Sigma dita di zinco è usata per assemblare i disegni ZFN approvati. Ogni disegno ZFN è assemblato e la sequenza verificato su una piattaforma alta clonazione throughput. Una volta che la produzione di tutti i disegni ZFN è completare ogni ZFN viene inviato alla validazione. 3. Validazione dei ZFNs personalizzati Progetti in ZFNspecie umana, topo, ratto o CHO sono validati nelle linee di cellule ben caratterizzati per ciascuna specie, un saggio a base di lievito viene usato per altri organismi o tipi cellulari. Costrutti ZFN vengono erogati nella linea cellulare appropriata nucleofection e le ZFNs sono espressi. DNA viene raccolto dal pool di cellule trasfettate ZFN e la regione di interesse è amplificato mediante PCR. Il-1 Cel saggio viene quindi effettuata sul prodotto PCR. Elettroforesi su gel viene eseguito sul test-1 Cel all'attività ZFN convalidato. Il disegno più alto ZFN attività come confermato dal Cel-1 test viene quindi fornito al cliente. ZFNs vengono consegnati in mRNA e DNA plasmidico con primer PCR per l'Cel-1 saggio e DNA genomico come controllo positivo. 4. Consegna dei ZFNs convalidati da Nucleofection Seme le cellule ad una densità di 2×10 5 cellule / ml il giorno prima nucleofection. Il giorno di nucleofection,estrarre cellule Linea Nucleofector Kit V e lasciare calda a temperatura ambiente. Aggiungere il supplemento al Nucleofection Solution V secondo il protocollo del produttore. Contare le celle. Densità cellulare dovrebbe essere tra 2,5-5×10 5 cellule / ml. Riempire una piastra da 6 pozzetti con 2 ml di mezzo in ciascun pozzetto e pre-riscaldare in un incubatore a CO 2 37 ° C per almeno 20 minuti prima nucleofection. Centrifugare 2×10 6 cellule per trasfezione (8×10 6 totale) a 200xg per 5 minuti. Lavare le cellule due volte con 20 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). Preparare le provette sperimentali: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico) Rimuovere la piastra da 6 pozzetti contenente supporti dal punto (6,5) da incubatrice. Risospendere le cellule in 400 pl (100 pl / reazione) di soluzione Nucleofection V. Una reazione alla volta, aggiungere 100 microlitri di cellule di ciascun DNA o mRNA contenente tubo. Trasfer la miscela ad una elettroporazione 2 millimetri cuvette e nucleofect su un Nucleofector con il programma appropriato. Subito dopo nucleofection di ciascun campione, con una pipetta di trasferimento per aggiungere ~ 500 microlitri di terreno preriscaldata dalla piastra da 6 pozzetti in fase (6,9) nella cuvetta. Quindi, trasferire accuratamente le cellule dalla cuvetta al mezzo rimanente preriscaldata nella piastra da 6 pozzetti. Fine tutte le reazioni e restituire la piastra da 6 pozzetti per la CO 2 incubatore a 37 ° C. 5. Raccolta DNA genomico dopo la consegna del ZFNs Piastra da 6 pozzetti – non raccogliere tutte le celle pool. E 'importante mantenere la cultura in modo da avere le celle a singolo clone di diluizione cella dopo aver confermato di avere Cel-1 digestione prodotti. Da uno a tre giorni dopo nucleofection raccogliere le cellule per preparare il DNA cromosomico con il GenElute mammiferi DNA genomico Kit Miniprep. 6. Cel-1 test </p> PCR amplificare il DNA genomico nei campioni di ZFN trasfettate e il positivo DNA genomico di controllo fornito nel kit, utilizzando i primer forniti. La reazione PCR è impostato con le seguenti condizioni: (vedi tabella in Custom ZFN bollettino tecnico). Per generare eteroduplex dai homoduplexes PCR prendono 10 microlitri di reazione PCR di ogni campione ZFN trattato più il controllo e utilizzare il seguente programma in un termociclatore: 95 ° C, 10 minuti 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / secondo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / secondo 4 ° C, indefinitamente Aggiungere 1 ml di enhancer e 1 ml di nucleasi S (dal numero di catalogo Transgenomic 706.025) ad ogni reazione e incubare a 42 ° C per 20-40 minuti. Eseguire le digestioni su un 10% di PAGE-TBE gel con marcatori adeguati, come ad esempio DNA Ladder DirectLoad widerange (Numero di catalogo D7058) (vedere i risultati in bollettino personalizzato ZFN tecnico). Suce segnale positivo è stato rilevato in ZFN trattati con le popolazioni di cel-I test, procedere all'isolamento e alla caratterizzazione clonale. 7. Isolamento e caratterizzazione di cloni Single-cell clonare i ZFN trattati con campioni con metodi standard, tra cui FACS e la clonazione di diluizione. Lasciare i cloni di espandersi a sufficienza, quindi dividere una certa proporzione di cellule per il raccolto DNA genomico, il congelamento indietro il resto come materiale sopraelevata. Amplificare il DNA genomico dai cloni usando i Cel-I primer e analizzare l'amplicone di Cel-I test (con e senza DNA WT diluiti in), oppure utilizzare questa amplicone di procedere direttamente genotipizzazione. Cloni candidati genotipo identificata come avente alleli cura il metodo preferito. 8. Risultati rappresentativi Un esempio di tutta CompoZr ZFN flusso è presentata in Figura 2. ZFNs vengono consegnatialle cellule dove si legano e si unirà la sequenza corretta di DNA che crea una rottura a doppio filamento (DSB). Il processo di riparazione naturale, non omologhe fine unione (NHEJ), ripara il DSB. In alcune istanze aberranti risultati NHEJ a delezione, inserzione o sostituzione di nucleotidi. Amplificazione PCR del DNA genomico risultati raccolti nella formazione eteroduplex tra wild type e ampliconi modificati dopo la denaturazione / fase di ricottura della reazione PCR. Aggiunta dei Cel-1 risultati enzimatiche nella scissione di eventuali molecole eteroduplici. Cel-1 risultati vengono risolti mediante analisi PAGE per confermare clivaggio ZFN. Figura 3 fornisce una schematica del saggio Cel-1 ed i risultati attesi. Rappresentative Cel-1 risultati sono contenuti nelle figure 4 e 5 Figura 4 contiene i risultati di una coppia molto attiva di ZFNs (21%) in cellule K562;. Figura 5 contiene i risultati di una coppia meno attivo (2,4%) di ZFNs inK562. Attività ZFN è confermato in entrambe le figure dalla presenza di due frammenti di PCR sotto il frammento di PCR parentale. Figura 1. ZFNs rappresentazione delle nucleasi associati dito di zinco. Sono progettati proteine ​​costituite da un dito di zinco DNA-binding dominio fuse al dominio di clivaggio della endonucleasi di restrizione FokI. Quando è legato come un eterodimero, ZFNs creare un doppio filamento pausa una specifica sequenza di DNA utente. Figura 2. Schema del flusso di lavoro personalizzato Servizio ZFN. Rappresentazione grafica del flusso di lavoro per generare una linea di cellule geneticamente modificate usando ZFNs CompoZr. Figura 3. Schematica del Cel-1 test e risultati. A) ZFN plasmide o mRNA r è consegnato alle cellule. B) Espressa bind ZFNs e tagliare la loro sequenza bersaglio creando una rottura a doppio filamento (DSB) in una porzione di cellule. C) la riparazione aberrante di alcuni DSB da parte di non-omologa finiscono entrare risultati in nucleotide inserimento o la cancellazione. D) Il DNA genomico viene raccolto dal pool di cellule transfettate e amplificato a livello del locus di interesse. EF) PCR prodotto è denaturato e ri-creando la formazione di ricotta heteroduplex tra wild type e ampliconi modificati. G) I Cel-1 di mismatch tra le endonucleasi di risultati del test in scissione delle molecole eteroduplici. H) Cel-1 enzima digerisce vengono risolti PAGE. Il rapporto osservato del prodotto di scissione a banda parenterale, determinato da ImageJ software, indica il taglio frazione e l'efficienza dei ZFNs. Figura 4. Cel-1 risultati dal 21% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all'indirizzo:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. Figura 5. Cel-1 risultati dal 2,4% ZFNs attivi software ImageJ è disponibile all'indirizzo:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .