Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

1. Benutzerdefinierte ZFN Design Process Um die ZFN Design Prozess zu beschleunigen, sollte ein Ermittler stellen: Informationen über das Ziel-Gen wie dem Gen-Namen, Arten und Gene Annotation / Identifikationsnummer. Ein klar gesagt über-all Ziel des Experiments (zB Knockout oder Knockin) Alle spezifischen Faktoren des Gens Ziel, das atypische Gen Aufbau, spezielle Biologie in der Genort verwickelt, oder keine homologen Regionen anderer Stelle im Genom enthalten. Das spezifische DNA-Sequenz für die Zinkfinger-Nucleasen zum Ziel. Die Sigma Bioinformatik Team führt in silico Design zum ersten ZFN Zinkfinger Zielorten zu entwickeln. Erste ZFN Zielorten an eine ZFN wissenschaftlichen technischer Berater zur Verfügung gestellt. Für weitere technisch komplexen Projekten arbeitet diese Sigma Wissenschaftler mit den Ermittlern, um das Projekt zu entwickeln. <li> Das Sigma Bioinformatik Team führt eine Analyse mit ZFN Algorithmen, um in silico ZFN Designs generieren. Dazu gehört auch eine ganze Genom Suche nach Off-Target-Sites, wiederholen Sie die Maskierung und SNP-Analyse für jede potentielle ZFN Zielort. Bioinformatik bietet die Top-ZFN Zielorten an die Ermittler für Kritik. Nach der Freigabe der potentielle ZFN Zielstellen, wird diese Information an die ZFN Produktionsteam vorgesehen, um die ZFN Herstellungsverfahren beginnen. 2. Benutzerdefinierte ZFN Produktion Die Sigma-Archiv von Zink-Finger-Module verwendet, die zugelassenen ZFN Designs montieren. Jedes Design ZFN montiert und Sequenz auf einem hohen Durchsatz Klonen Plattform verifiziert. Sobald die Produktion aller ZFN Designs abgeschlossen ist, wird jede ZFN wird zur Validierung geschickt. 3. Validierung von Custom ZFNs ZFN Projekte invon Mensch, Maus, Ratte oder CHO-Spezies in gut charakterisierten Zelllinien für jede Art validiert werden, wird ein Hefe-basierten Assays für andere Organismen oder Zelltypen verwendet. ZFN Konstrukte werden in den entsprechenden Zelllinie durch Nukleofektion geliefert und die ZFNs ausgedrückt werden. DNA wird aus dem Pool von ZFN transfizierten Zellen geerntet und die Region von Interesse PCR-amplifiziert. Die Cel-1-Assay wird dann auf der PCR-Produkt durchgeführt. Die Gelelektrophorese basiert auf der Cel-1-Assay zu validieren ZFN Aktivität ausgeführt werden. Die höchste Aktivität ZFN Design bestätigt durch die Cel-1-Assay wird dann an den Kunden. ZFNs sind in mRNA und Plasmid-DNA mit PCR-Primer für die Cel-1-Assay und genomische DNA als eine positive Kontrolle geliefert. 4. Lieferung von Validated ZFNs durch Nukleofektion Samen der Zellen bei einer Dichte von 2×10 5 Zellen / ml am Tag vor Nukleofektion. Am Tag der Nukleofektion,nehmen Cell Line Nucleofector Kit V und lassen auf Raumtemperatur erwärmt. Fügen Sie die Ergänzung des Nucleofection Lösung V nach dem Protokoll des Herstellers. Zählen Sie die Zellen. Die Zelldichte sollte zwischen 2,5-5×10 5 Zellen / ml liegen. In eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 ml des Mediums in jeder Vertiefung und Vorwärmen in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten vor Nukleofektion. Zentrifuge 2×10 6 Zellen pro Transfektion (8×10 6 insgesamt) bei 200xg für 5 Minuten. Waschen der Zellen zweimal mit 20 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Bereiten experimentellen Röhren: (siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin) Entfernen Sie die 6-Well-Platte mit Medien aus Schritt (6,5) aus Inkubator. Die Zellen in 400 ul (100 ul / Reaktion) von Nucleofection Lösung V. Eine Reaktion zu einer Zeit, werden 100 ul Zellen zu jeder DNA oder mRNA-haltigen Rohr. Transfer das Gemisch auf eine 2 mm Elektroporationsküvette und nucleofect auf einem Nucleofector mit einem geeigneten Programm. Unmittelbar nach Nukleofektion jeder Probe, Hilfe einer Pipette auf ~ 500 pl vorgewärmtem Medium aus der 6-Well-Platte in Schritt (6.9) hinzufügen, um die Küvette. Dann transferieren Sie Zellen aus der Küvette mit dem übrigen vorgewärmtem Medium in der 6-Well-Platte. Beende alle Reaktionen und senden Sie das 6-Well-Platte auf die CO 2-Inkubator bei 37 ° C 5. Ernte genomische DNA nach Lieferung der ZFNs 6-Well-Platte – nicht ernten all der gepoolten Zellen. Es ist wichtig, um die Kultur zu erhalten, um Zellen zu einzelnen Zelle Verdünnung Klon haben, nachdem Sie, dass Sie Cel-1 Verdauung Produkte zu bestätigen. Ein bis drei Tage nach Nukleofektion Sammeln der Zellen chromosomale DNA herzustellen mit der GenElute Säuger genomische DNA-Miniprep-Kit. 6. Cel-1-Test </p> PCR-Amplifikation der genomischen DNA aus den Proben ZFN transfizierten und der positiven Kontrolle genomischer DNA mit dem Kit mitgeliefert, mit den mitgelieferten Primer. (Siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin): Die PCR-Reaktion wird mit den folgenden Bedingungen eingestellt. Um Heteroduplexe aus den PCR-Homoduplexe generieren nehmen 10 ul PCR-Reaktion aus jeder ZFN behandelten Probe zuzüglich der Kontrolle und verwenden Sie das folgende Programm auf einem Thermocycler: 95 ° C, 10 Minuten 95 ° C bis 85 ° C, 2 ° C / Sekunde 85 ° C bis 25 ° C, -0,1 ° C / Sekunde 4 ° C, auf unbestimmte Zeit Fügen Sie 1 ul-Enhancer und 1 ul Nuclease S (ab Transgenomic Katalognummer 706025) zu jeder Reaktion und inkubieren bei 42 ° C für 20-40 Minuten. Führen Sie die Aufschlüsse auf einem 10% PAGE-TBE-Gel mit der richtigen Marker wie DirectLoad WideRange DNA-Leiter (Katalognummer D7058) (siehe Ergebnisse in Custom ZFN Technical Bulletin). Aufce positives Signal in ZFN-behandelten Population wurde durch Cel-I-Test nachgewiesen, um klonale Isolierung und Charakterisierung fort. 7. Klonale Isolierung und Charakterisierung Einzel-Zell-Klon die ZFN-behandelten Proben mittels Standardverfahren einschließlich FACS und Verdünnungsklonierung. Lassen Sie die Klone, um ausreichend zu erweitern, dann spalten gewissen Anteil an Zellen für genomische DNA Ernte, Einfrieren wieder den Rest als überhöhte Material. Verstärken genomische DNA aus den Klonen unter Verwendung der Primer Cel-I und Analyse der Fragments durch Cel-I-Assay (mit und ohne WT DNA versetzt in), oder alternativ diese Amplikon, direkt zum Genotypisierung. Genotyp Kandidaten-Klone als mit bearbeitet Allele durch das bevorzugte Verfahren identifiziert. 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel des gesamten CompoZr ZFN Workflow ist in 2 dargestellt. ZFNs geliefertdie Zellen, wo sie binden und zu spalten die entsprechende DNA-Sequenz, die eine Doppel-(DSB) erstellt. Die natürliche Reparatur-Prozess, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), repariert die DSB. In einigen Fällen aberrante NHEJ kommt es zur Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden. PCR-Amplifikation von genomischer DNA geerntet Ergebnisse in Heteroduplex-Bildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons nach der Denaturierung / Annealing-Schritts der PCR-Reaktion. Die Zugabe der Cel-1-Enzym zur Spaltung keine Heteroduplexmoleküle. Cel-1 Ergebnisse werden durch PAGE-Analyse gelöst zu ZFN Spaltung zu bestätigen. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Cel-1-Test und der erwarteten Ergebnisse. Repräsentative Cel-1 Ergebnisse sind in den 4 und 5 enthalten Abbildung 4 enthält aus einer sehr aktiven Paar ZFNs (21%) in K562-Zellen;. Abbildung 5 enthält die Ergebnisse von einer weniger aktiven Paar (2,4%) der ZFNs inK562-Zellen. ZFN-Aktivität ist in beiden Figuren durch die Anwesenheit von zwei PCR-Fragmente unter der elterlichen PCR-Fragment bestätigt. Abbildung 1. Darstellung der gebundenen Zink-Finger-Nukleasen. ZFNs sind Proteine ​​einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an die Spaltdomäne des FokI-Restriktionsendonuklease umfasst entwickelt. Wenn als ein Heterodimer gebunden ist, zu schaffen ZFNs eine doppelsträngige Pause zu einer vom Benutzer angegebenen DNA-Sequenz. Abbildung 2. Schematische Darstellung des benutzerdefinierten ZFN Service-Workflow. Grafische Darstellung der Workflow um einen gentechnisch veränderten Zelllinie unter Verwendung CompoZr ZFNs generieren. Abbildung 3. Schematische Darstellung des Cel-1-Test und die Ergebnisse. A) ZFN Plasmid-o r mRNA an Zellen geliefert. B) ausgedrückt ZFNs binden und schneiden sich Zielsequenz, eine doppelte (DSB) in einem Teil der Zellen. C) aberrante Reparatur von einigen DSBs durch nicht-homologe Endverknüpfung Ergebnisse in der Nucleotid-Insertion oder Deletion. D) Genomische DNA wird aus dem Pool von transfizierten Zellen geerntet und verstärkt an der Stelle von Interesse. EF) PCR-Produkt wird denaturiert und erneut geglüht schaffen Heteroduplexbildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons. G) Die Cel-1 Fehlpaarungsendonuclease Assay zur Spaltung von Heteroduplex-Moleküle. H) Cel-1-Enzym verdaut werden durch PAGE aufgelöst. Das beobachtete Verhältnis von Spaltprodukt auf eine parenterale Band, das von ImageJ Software bestimmt, zeigt die Fraktion Schnitt und die Effizienz der ZFNs. Abbildung 4. Cel-1 ergibt sich aus 21% aktiven ZFNs ImageJ Software finden Sie unter.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. Abbildung 5. Cel-1 ergibt sich aus 2,4% aktive ZFNs ImageJ Software ist verfügbar unter:. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .