Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

1. Processus de conception personnalisée ZFN Pour accélérer le processus de conception ZFN, un enquêteur doit fournir: Informations sur le gène cible telles que le nom du gène, espèce, et le gène de l'annotation / numéro d'identification. Une clairement indiqué sur-tout l'objectif de l'expérience (par exemple, ou Knockout Knockin) Tous les facteurs spécifiques de la cible du gène qui comprennent structure génique atypique, la biologie particulière impliqué dans le locus génétique, ou des régions homologues dans le reste du génome. La plage spécifique de séquence d'ADN pour le doigt de zinc pour cibler nucléases. L'équipe de Sigma bioinformatique mène in silico ZFN conception pour développer des sites initiaux à doigts de zinc cibles. Les premiers sites cibles ZFN sont fournis à un consultant technique et scientifique ZFN. Pour les projets plus complexes techniquement, ce scientifique Sigma travaille avec les enquêteurs de mettre au point la stratégie du projet. <li> Le Sigma bioinformatique équipe procède à une analyse des algorithmes pour générer ZFN dans les conceptions ZFN silico. Cela inclut une recherche du génome entier pour hors-cible des sites, le masquage de répétition, et l'analyse des SNP pour chaque site cible ZFN potentiel. Bioinformatique fournit les meilleurs sites cibles ZFN à l'enquêteur aux fins d'examen. Lors de l'approbation des sites potentiels cibles ZFN, cette information est fournie à l'équipe de production ZFN pour commencer le processus de fabrication ZFN. 2. Personnalisé de production ZFN L'archive Sigma de modules à doigt de zinc est utilisé pour assembler les modèles ZFN approuvés. Chaque modèle est assemblé et ZFN séquence vérifiée sur une plate-forme de clonage à haut débit. Une fois la production de tous les modèles ZFN est terminée, tous les ZFN est envoyé à la validation. 3. Validation des ZFNs personnalisés Des projets dans ZFNespèce humaine, la souris, de rat ou de CHO sont validés dans des lignées cellulaires bien caractérisées pour chaque espèce, un dosage à base de levure est utilisé pour d'autres organismes ou des types cellulaires. Constructions ZFN sont livrés dans la lignée cellulaire appropriée par nucléofection et les ZFNs sont exprimés. ADN est récolté à partir du pool de cellules transfectées ZFN et la région d'intérêt est amplifié par PCR. Le Cel-1 test est ensuite effectué sur le produit de PCR. L'électrophorèse sur gel est exécuté sur le Cel-1 dosage de l'activité ZFN validé. La conception plus forte activité ZFN tel que confirmé par le dosage Cel-1 est ensuite fourni au client. ZFNs sont livrés en ARNm et l'ADN plasmidique ainsi amorces de PCR pour l'essai Cel-1 et l'ADN génomique comme témoin positif. 4. La livraison des ZFNs validés par nucléofection Graine les cellules à une densité de 2×10 5 cellules par ml de la veille nucléofection. Le jour de nucléofection,sortez portable Ligne Nucleofector Kit V et laisser tiédir à température ambiante. Ajouter le supplément à la solution nucléofection V selon le protocole du fabricant. Compter les cellules. Densité de cellules doit être compris entre 2,5-5×10 5 cellules par ml. Remplir une plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu dans chaque puits et pré-chaud dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C pendant au moins 20 minutes avant nucléofection. Centrifuger 2×10 6 cellules par transfection (8×10 6 au total) au 200xg pendant 5 minutes. Laver les cellules deux fois avec 20 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Préparer des tubes expérimentaux: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique) Retirer la plaque à 6 puits contenant les médias de l'étape (6.5) de l'incubateur. Remettre en suspension les cellules dans 400 pi (100 pi / réaction) de la solution nucléofection V. Un réactionnel à la fois, ajouter 100 pl de cellules à chaque ADN ou ARNm contenant du tube. Transfer le mélange à une électroporation 2 mm cuvette et sur une nucleofect Nucleofector avec le programme approprié. Immédiatement après nucléofection de chaque échantillon, utiliser une pipette de transfert pour ajouter ~ 500 pi de milieu préchauffé de la plaque à 6 puits à l'étape (6,9) dans la cuvette. Puis, transférez les cellules de la cuvette au milieu restant préchauffé dans la plaque à 6 puits. Terminer toutes les réactions et retourner la plaque à 6 puits à l'incubateur à CO 2 à 37 ° C. 5. La récolte d'ADN génomique après la livraison de ZFNs Des plaques 6 puits – ne pas récolter la totalité des cellules mises en commun. Il est important de maintenir la culture dans le but d'avoir des cellules à clone cellulaire de dilution simple une fois que vous confirmez que vous avez produits Cel-1 de digestion. Un à trois jours après nucléofection recueillir les cellules pour préparer l'ADN chromosomique utilisant le GenElute l'ADN génomique des mammifères Miniprep Kit. 6. Cel-1 Test </p> Amplifier par PCR de l'ADN génomique à partir des échantillons ZFN transfectées et l'ADN génomique de contrôle positif fourni dans le kit, en utilisant les amorces fournies. La réaction de PCR est mis en place avec les conditions suivantes: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique). Pour générer des hétéroduplex homoduplexes PCR prendre 10 ul de la réaction PCR à partir de chaque échantillon ZFN traités ainsi que le contrôle et utiliser le programme suivant sur un thermocycleur: 95 ° C, 10 minutes 95 ° C à 85 ° C, -2 ° C / seconde 85 ° C à 25 ° C, -0,1 ° C / seconde 4 ° C, indéfiniment Ajouter 1 ul de enhancer et 1 ul de nucléase S (à partir de 706 025 Numéro de catalogue Transgenomic) à chaque réaction et incuber à 42 ° C pendant 20-40 minutes. Exécuter les digestions sur un 10% PAGE-TBE gel avec des marqueurs appropriés, tels que l'ADN Ladder DirectLoad WideRange (D7058 Numéro de catalogue) (voir les résultats dans le bulletin technique personnalisé ZFN). SurCE signal positif a été détecté dans ZFN-traités par les populations cel-je test, procéder à l'isolement et la caractérisation des clones. 7. Isolement et caractérisation de clones Une seule cellule clone les échantillons ZFN-traités par des méthodes standards, y compris FACS et le clonage de dilution. Autoriser les clones se développer suffisamment, puis fractionnez une certaine proportion de cellules pour la récolte d'ADN génomique, le gel de retour le reste en tant que matériau en banque. Amplifier l'ADN génomique des clones en utilisant les amorces Cel-I et d'analyser l'amplicon par Cel-je test (avec et sans ADN WT atteint un sommet en), ou encore utiliser cet amplicon de procéder directement au génotypage. Clones candidats génotype identifié comme ayant des allèles édité par la méthode préférée. 8. Les résultats représentatifs Un exemple de l'ensemble du flux de travail CompoZr ZFN est présenté dans la Figure 2. ZFNs sont livréspour les cellules où ils se lient et coupent la séquence d'ADN appropriée qui crée une cassure double brin (DSB). Le processus naturel de réparation, non homologue (NHEJ extrémité de jonction), les réparations de l'ORD. Dans certains résultats aberrants dans les instances NHEJ suppression, insertion ou substitution de nucléotides. Amplification par PCR de la récolte des résultats d'ADN génomique dans la formation des hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés après la dénaturation / étape de recuit de la réaction de PCR. Ajout des résultats enzymatiques Cel-1 dans le clivage de toutes les molécules hétéroduplex. Cel-1 résultats sont résolus par l'analyse PAGE pour confirmer le clivage ZFN. La figure 3 présente un schéma de l'essai Cel-1 et les résultats escomptés. Représentant de CEL-1 résultats sont contenus dans les figures 4 et 5 la figure 4 contient les résultats d'une paire très actif de ZFNs (21%) dans les cellules K562;. Figure 5 contient les résultats d'une paire moins actif (2,4%) de ZFNs dansLes cellules K562. Activité ZFN est confirmée dans les deux chiffres par la présence de fragments de PCR deux sous le fragment parentale PCR. Figure 1. ZFNs Représentation des nucléases à doigt de zinc liés. Sont conçus protéines composées d'un doigt de zinc domaine liant l'ADN fusionné au domaine de clivage de l'endonucléase de restriction FokI. Lorsqu'il est lié comme un hétérodimère, ZFNs créer une cassure double brin à une séquence d'ADN d'utilisateur spécifié. Figure 2. Schéma du workflow ZFN service personnalisé. Représentation graphique du workflow pour générer une lignée de cellules génétiquement modifiées à l'aide ZFNs CompoZr. Figure 3. Schéma de l'essai Cel-1 et les résultats. A) ZFN plasmide o ARNm r est délivré à cellules. B) Exprimé bind ZFNs et couper leur séquence cible la création d'une pause double brin (DSB) dans une partie des cellules. C) la réparation aberrante de certains conseils scolaires de district par des non-homologue fin de rejoindre des résultats à l'insertion ou la suppression de nucléotides. D) l'ADN génomique est récolté à partir du pool de cellules transfectées et amplifié au niveau du locus d'intérêt. EF) produit de PCR est dénaturé et re-création de recuit formation d'hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés. G) Les résultats Cel-1 inadéquation endonucléase de dosage dans le clivage de molécules hétéroduplex. H) Cel-1 enzyme digère sont résolus par PAGE. Le ratio observé de produit de clivage à la bande parentérale, déterminée par logiciel ImageJ, indique la coupe de fraction et de l'efficacité des ZFNs. Figure 4. Cel-1 résulte de 21% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. Figure 5. Cel-1 résulte de 2,4% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .