Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

1. Processo de Design personalizado ZFN Para agilizar o processo de design ZFN, um investigador deve fornecer: Informação sobre o gene alvo, tais como o nome do gene, a espécie, e número de genes de anotação / identificação. Um declarou claramente sobre-tudo objetivo do experimento (por exemplo, Knockout, ou Knockin) Quaisquer factores específicos do gene alvo que incluem estrutura do gene atípico, biologia especial implicada no locus genético, ou quaisquer regiões homólogas em outras partes do genoma. O intervalo específico de seqüência de DNA para o dedo de zinco nucleases atingir. A Sigma equipe de bioinformática conduz in silico projeto ZFN desenvolver iniciais de zinco sítios-alvo do dedo. Sítios-alvo iniciais ZFN são fornecidos com um consultor científico ZFN técnica. Para projetos mais complexos tecnicamente, este cientista Sigma trabalha com os investigadores a desenvolver a estratégia do projecto. <li> A Sigma equipe de bioinformática realiza uma análise com algoritmos para gerar ZFN em projetos silico ZFN. Isso inclui uma pesquisa do genoma inteiro para fora do alvo sites, mascaramento, repetição e análise de SNP para cada site ZFN potencial alvo. Bioinformática fornece os sites de destino top ZFN ao investigador para revisão. Após a aprovação dos locais alvo potenciais ZFN, essa informação é fornecida para a equipe de produção ZFN para iniciar o processo de fabricação ZFN. 2. Produção ZFN personalizado O arquivo Sigma de módulos de dedo de zinco é usado para montar os projetos aprovados ZFN. Cada projeto ZFN é montado e seqüência verificada em uma plataforma alta taxa de clonagem. Uma vez que a produção de todos os projetos ZFN é completar todos os ZFN é enviado para validação. 3. Validação de ZFNs personalizados Projetos em ZFNespécie humana, ratinho, rato ou CHO são validados em linhas de células bem caracterizadas para cada espécie, um ensaio baseado em levedura é usado para outros organismos ou tipos de células. Construções ZFN são entregues para a linha celular apropriada por nucleofection e os ZFNs são expressos. O DNA é colhido a partir do pool de células transfectadas ZFN e da região de interesse é amplificado por PCR. O Cel-1 ensaio é então conduzida sobre o produto de PCR. Eletroforese em gel é executado no-1 Cel ensaio para atividade ZFN validado. A concepção mais elevada ZFN actividade como confirmado pelo ensaio Cel-1 é então fornecida ao cliente. ZFNs são entregues em ARNm e ADN de plasmídeo, juntamente com iniciadores de PCR para o ensaio Cel-1 e DNA genómico como um controlo positivo. 4. Entrega de ZFNs validados pelo Nucleofection Semente as células a uma densidade de 2×10 células / ml 5 o dias antes nucleofection. No dia da nucleofection,tirar Linhagem Celular Nucleofector Kit V e deixe aquecer à temperatura ambiente. Adicionar o suplemento ao Nucleofection Solução V de acordo com o protocolo do fabricante. Contar as células. Densidade de células deve ser entre 2,5-5×10 5 células / ml. Encher uma placa de 6 poços com 2 ml de meio em cada poço e pré-aquecido em um incubador de CO2 a 37 ° C durante pelo menos 20 minutos antes da nucleofection. Centrifugar 2×10 células por transfecção 6 (total 8×10 6) em 200xg durante 5 minutos. Lave as células duas vezes com 20 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS). Prepare os tubos experimentais: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN) Remova a placa de 6 poços contendo meio a partir do passo (6,5) da incubadora. Ressuspender as células em 400 uL (100 uL / ​​reacção) de solução de Nucleofection V. Uma reacção a uma hora, adicionar 100 uL de células para cada DNA ou mRNA contendo-tubo. Transfer a mistura para uma cuvete de electroporação 2 milímetros e nucleofect sobre uma Nucleofector com o programa apropriado. Imediatamente após nucleofection de cada amostra, utilizar uma pipeta de transferência para adicionar ~ uL de meio de 500 pré-aquecido a partir da placa de 6 poços no passo (6,9) para a cuvete. Em seguida, transferir cuidadosamente a partir de células da cuvete para o meio restante pré-aquecido na placa de 6 poços. Terminar todas as reacções e retornar a placa de 6 poços para a incubadora de CO2 a 37 ° C. 5. Colheita DNA genômico após a entrega do ZFNs 6-bem placa – não colher todas as células em pool. É importante manter a cultura, a fim de ter células para clone de célula única diluição depois de confirmar que você tem produtos Cel-1 de digestão. Uma a três dias após a nucleofection recolher as células para preparar DNA cromossómico usando o GenElute Mammalian DNA genómico Kit Miniprep. 6. Cel-1 Ensaio </p> PCR amplificar o ADN genómico a partir das amostras ZFN transfectadas eo DNA genómico positivo de controlo fornecidos no kit, utilizando os iniciadores fornecidos. A reação de PCR está configurado com as seguintes condições: (ver tabela em Custom boletim técnico ZFN). Para gerar heteroduplexes dos homoduplexes PCR tomar 10 ul de reacção de PCR a partir de cada amostra tratada ZFN mais o controle e utilizar o seguinte programa no termociclador: 95 ° C, 10 minutos 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo 4 ° C, indefinidamente Adicionar 1 ml de enhancer e 1 uL de Nuclease S (a partir de Número de Catálogo Transgenomic 706.025) a cada reacção e incubar a 42 ° C durante 20-40 minutos. Executar as digestões em um 10% gel TBE-PAGE com marcadores apropriados, tais como DirectLoad Ladder DNA WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados em boletim técnico personalizado ZFN). Emce sinal positivo foi detectado em ZFN tratados com populações por cel-I ensaio, proceder ao isolamento e caracterização de clones. 7. Isolamento e Caracterização Clonal De uma única célula de clones das amostras ZFN-tratadas por métodos padrão, incluindo FACS e clonagem de diluição. Permita que os clones para expandir o suficiente, então, dividir alguma proporção de células para a colheita do DNA genômico, o congelamento de volta o restante como material depositado. Amplificar o ADN genómico a partir dos clones utilizando os primers Cel-I e analisar o fragmento amplificado por Cel-I de ensaio (com e sem ADN WT enriquecida em), ou alternativamente utilizar este fragmento amplificado para seguir directamente para a genotipagem. Clones candidatos Genótipo identificados como tendo alelos editado por o método preferido. 8. Os resultados representativos Um exemplo de todo o CompoZr ZFN fluxo de trabalho é apresentado na Figura 2. ZFNs são entreguespara as células onde eles se ligam e clivar a sequência de ADN adequada que cria uma quebra de cadeia dupla (DSB). O processo de reparação natural, não-homóloga acabam unindo (NHEJ), os reparos do DSB. Em alguns casos resultados aberrantes NHEJ em inserção, deleção ou substituição de nucleótidos. A amplificação por PCR de ADN genómico colhidas resultados na formação de heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados após a desnaturação / etapa de recozimento da reacção de PCR. Além dos resultados Cel-1 enzima na clivagem de quaisquer moléculas de heteroduplex. Cel-1 resultados são resolvidos por análise de PAGE para confirmar a clivagem ZFN. A Figura 3 fornece um diagrama esquemático do ensaio Cel-1 e os resultados esperados. Representativos Cel-1 resultados estão contidos nas Figuras 4 e 5 A Figura 4 contém os resultados de um par muito activa de ZFNs (21%) em células K562;. Figura 5 contém resultados de um par menos activo (2,4%) de ZFNs emCélulas K562. Actividade ZFN é confirmada em ambas as figuras pela presença de dois fragmentos de PCR abaixo do fragmento de PCR parental. Figura 1. ZFNs representação de nucleases de dedo de zinco ligados. São concebidos proteínas compostas de um dedo de zinco de ligação do ADN do domínio fundido com o domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI. Quando ligado como um heterodímero, ZFNs criar uma quebra de cadeia dupla em uma seqüência de DNA do usuário especificado. Figura 2. Esquema do fluxo de trabalho personalizado Serviço ZFN. Representação gráfica do fluxo de trabalho para gerar uma linhagem de células geneticamente modificadas utilizando ZFNs CompoZr. Figura 3. Esquemática do ensaio Cel-1 e os resultados. A) ZFN o plasmídeo mRNA r é entregue a células. B) Expressa ligam ZFNs e cortar sua seqüência alvo a criação de uma ruptura de fita dupla (DSB) em uma porção de células. C) reparação aberrante de alguns DSBs por não-homóloga acabar juntando resultados na inserção de nucleotídeo ou eliminação. D) O ADN genómico é colhido a partir do pool de células transfectadas e amplificado no locus de interesse. EF) produto de PCR é desnaturado e re-recozida a criação de formação heteroduplex entre tipo selvagem e amplicões modificados. G) Os Cel-1 de desadaptação resultados de endonucleases de ensaio na clivagem de moléculas de heteroduplex. H) Cel-1 enzima digere são resolvidos por PAGE. A proporção observada de produto de clivagem a banda parentérica, determinada por ImageJ software, indica a fracção de corte e da eficiência das ZFNs. Figura 4. Cel-1 resultados de 21% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. Figura 5. Cel-1 resulta de 2,4% ZFNs ativos software ImageJ está disponível em:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .