Genoma Edición con CompoZr nucleasas de dedos de zinc personalizados (ZFNs)

1. Custom ZFN Proceso de Diseño Para acelerar el proceso de diseño ZFN, el investigador debe proporcionar: La información sobre el objetivo de genes tales como el nombre de genes, especies y el número de genes anotación / identificación. Un declaró claramente por encima de todo-objetivo del experimento (por ejemplo, o el golpe de gracia Knockin) Los factores específicos de la diana de genes que incluyen la estructura de genes atípica, biología especial implicado en el locus genético, o cualquier regiones homólogas de otras partes del genoma. La gama específica de la secuencia de ADN para el dedo de zinc nucleasas para apuntar. El equipo de Sigma bioinformática lleva a cabo in silico de diseño para desarrollar ZFN iniciales de zinc sitios de destino de los dedos. Iniciales de los sitios objetivo ZFN se proporcionan a un ZFN consultor técnico científico. Para los proyectos de mayor complejidad técnica, este científico Sigma trabaja con los investigadores para desarrollar la estrategia del proyecto. <li> El equipo de bioinformática Sigma lleva a cabo un análisis de algoritmos para generar ZFN in silico diseños ZFN. Esto incluye una búsqueda completa del genoma de los sitios fuera de objetivo, la máscara de la repetición, y el análisis de SNP para cada sitio ZFN objetivo potencial. Bioinformática ofrece los mejores sitios ZFN objetivo para el investigador para su revisión. Tras la aprobación de los lugares de destino potenciales ZFN, esta información se proporciona al equipo de producción ZFN para comenzar el proceso de fabricación ZFN. 2. Producción personalizada ZFN El archivo de los módulos de Sigma dedo de zinc se utiliza para montar los diseños ZFN aprobados. Cada diseño ZFN está montada y secuencia verificada sobre una plataforma de rendimiento clonación alta. Una vez que la producción de todos los diseños ZFN se completa cada ZFN se envía a la validación. 3. Validación de ZFNs personalizados ZFN proyectos enespecies humano, ratón, rata o CHO se validan en líneas celulares bien caracterizadas para cada especie, un ensayo basado en la levadura se utiliza para otros organismos o tipos de células. Construcciones ZFN se entregan en la línea celular apropiada por nucleofection y los ZFNs expresan. ADN se extrae de la piscina de las células transfectadas ZFN y la región de interés es amplificado por PCR. El Cel-1 ensayo se llevó a cabo entonces en el producto de PCR. La electroforesis en gel se ejecuta en el Cel-1 ensayo a la actividad ZFN validado. El diseño de la actividad más alta ZFN como se confirma por el ensayo de Cel-1 A continuación se proporcionan para el cliente. ZFNs son entregados en el ARNm y ADN plásmido junto con los cebadores de PCR para el ensayo de Cel-1 y ADN genómico como un control positivo. 4. La entrega de ZFNs Validado por nucleofection Semillas de las células a una densidad de 2×10 5 células / ml el día antes de nucleofection. En el día de nucleofection,sacar Línea Celular nucleofector Kit V y deje calentar a temperatura ambiente. Agregue el complemento de la solución nucleofection V de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cuenta las células. La densidad celular debe estar entre 2,5-5×10 5 células / ml. Llenar una placa de 6 pocillos con 2 ml de medio en cada pocillo y se pre-calentamiento en una incubadora de CO 2 a 37 ° C durante al menos 20 minutos antes de nucleofection. Centrifugar 2×10 6 células por transfección (8×10 6 total) a 200xg durante 5 minutos. Lavar las células dos veces con 20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Preparar los tubos experimentales: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico) Retirar la placa de 6 pocillos que contienen los medios de comunicación desde el paso (6,5) de la incubadora. Resuspender las células en 400 l (100 l / reacción) de la solución de nucleofection V. Una reacción a la vez, añadir 100 ml de células para cada ADN o ARNm tubo que contiene. Transfer la mezcla a una cubeta de electroporación de 2 mm y nucleofect en un nucleofector con el programa apropiado. Inmediatamente después de nucleofection de cada muestra, utiliza una pipeta para añadir ~ 500 l de medio precalentado de la placa 6-bien en el paso (6,9) a la cubeta. Entonces, cuidadosamente transferir las células de la cubeta para el medio restante precalentada en la placa de 6 pocillos. Terminar todas las reacciones y devolver la placa de 6 pocillos a la incubadora de CO 2 a 37 ° C. 5. La recolección de ADN genómico tras la entrega de ZFNs 6-así placa – no recoger todas las células agrupadas. Es importante mantener la cultura a fin de que las células a solo clon de células de dilución después de confirmar que usted tiene productos Cel-1 digestión. De uno a tres días después de nucleofection recoger las células para preparar ADN cromosómico utilizando el ADN de mamífero genómico GenElute Miniprep kit. 6. Cel.-1 Ensayo </p> Amplificar por PCR del DNA genómico de las muestras de ZFN transfectadas y el ADN genómico de control positivo incluido en el kit, utilizando los cebadores suministrados. La reacción de PCR se configura con las siguientes condiciones: (véase el cuadro personalizado ZFN boletín técnico). Para generar heterodúplex de los homodúplex PCR tomar 10 l de reacción de PCR de cada muestra ZFN trata además de un control y utilizar el siguiente programa en un termociclador: 95 ° C, 10 minutos 95 ° C a 85 ° C, -2 ° C / segundo 85 ° C a 25 ° C, -0,1 ° C / segundo 4 ° C, por tiempo indefinido Añadir 1 l de potenciador y 1 l de nucleasa S (número de catálogo de Transgenomic 706.025) a cada reacción y se incuba a 42 ° C durante 20-40 minutos. Ejecutar las digestiones en un 10% PAGE-TBE gel con marcadores adecuados, tales como escalera DirectLoad ADN WideRange (Número de catálogo D7058) (ver resultados en Custom ZFN boletín técnico). Ence la señal positiva se ha detectado en ZFN tratados con las poblaciones por la CEL-I de ensayo, proceder al aislamiento y la caracterización clonal. 7. Aislamiento y caracterización de clones De un solo clon de células de las muestras ZFN tratados por métodos estándar, incluyendo FACS y la clonación de dilución. Permita que los clones para ampliar lo suficiente, a continuación, dividir una cierta proporción de las células para la cosecha de ADN genómico, congelando de nuevo el resto como material de bancos. Amplificar el ADN genómico de los clones usando los cebadores Cel-I y analizar la amplificación por Cel-I de ensayo (con y sin ADN WT se disparó en), o, alternativamente, utilizar este amplicón de proceder directamente a la determinación del genotipo. Genotipo clones candidatos identificados con alelos editados por el método preferido. 8. Los resultados representativos Un ejemplo de la totalidad del flujo de trabajo CompoZr ZFN se presenta en la Figura 2. ZFNs se entregana las células donde se unen y escindir la secuencia de ADN adecuada que crea un salto de doble hebra (OSD). El proceso de reparación natural, de extremos no homólogos (NHEJ), reparaciones del OSD. En algunos casos los resultados aberrantes NHEJ en eliminación, inserción o sustitución de nucleótidos. Amplificación por PCR del DNA genómico cosechado resultados en la formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados después de la desnaturalización / hibridación paso de la reacción de PCR. La adición de los resultados de enzimas Cel-1 en la escisión de las moléculas heterodúplex. Cel-1 resultados se resuelven mediante el análisis PAGE para confirmar la escisión ZFN. Figura 3 proporciona una vista esquemática del ensayo Cel-1 y los resultados esperados. Representativos Cel-1 resultados están contenidos en las figuras 4 y 5 Figura 4 contiene los resultados de un par muy activa de ZFNs (21%) en células K562;. Figura 5 contiene los resultados de un par menos activo (2,4%) de ZFNs enCélulas K562. Actividad ZFN se confirma en ambas figuras por la presencia de dos fragmentos de PCR por debajo del parental fragmento de PCR. Figura 1. ZFNs Representación de los plazos nucleasas de dedos de zinc. Se han diseñado compuestos por proteínas dedo de zinc de unión al ADN de dominio fusionado al dominio de corte de la endonucleasa de restricción FokI. Cuando se une como un heterodímero, ZFNs crear un salto de doble cadena en una secuencia de ADN de usuario especificado. Figura 2. Esquema del flujo de trabajo de servicio personalizado ZFN. Representación gráfica del flujo de trabajo para generar una línea de células modificadas genéticamente utilizando ZFNs CompoZr. Figura 3. Esquema del ensayo Cel-1 y los resultados. A) ZFN plásmido o ARNm r es entregado a las células. B) Expresó unen ZFNs y cortar la secuencia objetivo la creación de una rotura de doble cadena (DSB) en una porción de las células. C) la reparación aberrante de algunos DSBs por no unirse a fin homóloga resultados en la inserción o deleción de nucleótidos. D) El ADN genómico se extrae de la piscina de las células transfectadas y amplificada en el locus de interés. FE) del producto de PCR se desnaturaliza y se re-creación de recocido formación de heterodúplex entre el tipo salvaje y amplicones modificados. G) Los Cel-1 desajuste los resultados del ensayo de endonucleasas en la escisión de las moléculas heterodúplex. H) Cel-1 enzima digiere se resuelven por PAGE. La relación observada de producto de escisión a la banda parenteral, determinado por el software ImageJ, indica la fracción de corte y la eficiencia de los ZFNs. Figura 4. Cel-1 los resultados de ZFNs 21% activos de software ImageJ está disponible en:._blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/. Figura 5. Cel-1 los resultados de un 2,4% ZFNs activos de software ImageJ está disponible en:. http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS .