Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)
Summary
CompoZr пользовательских цинк-Finger нуклеазы (ZFN) Сервис позволяет точного редактирования генома любого организма или клеточной линии в любой локус определяется пользователем. В этой статье описывается процесс проектирования, изготовления, проверки и реализации службы CompoZr пользовательских ZFN.
Abstract
Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA “half-site” of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers “home” to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator’s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.
Protocol
Discussion
После ZFN модифицированные клетки выделяют у них постоянные и наследственные ДНК модификации. В результате способность генерировать устойчиво изменение клеточной линии или породы животных с заданными генетическими модификациями, чтобы провести исследования. CompoZr пользовательских ZFNs обеспечивают надежный метод для редактирования генома в самых различных типов клеток. Публикация генома успешного редактирования с ZFNs включает, но не ограничиваясь клеточных линий человека, мыши, крысы, данио, лягушку, свиней и модели СНО исследований. 3,4,5,6,7,8,9 возможность создания двухцепочечной перерыв в нужной целевой сайт в указанный тип клеток обеспечивается при ZFNs правильно доставлен в камеру. Кроме того, можно выполнять последовательные изменения пальцем цинка в камеру для того, чтобы иметь более одной генетической модификации в ячейке 10. Возможность выбора определенной последовательности целей и изменить только данного локуса является основной причиной для возможности создания нескольких модификацийкатионов.
CompoZr пользовательских ZFN сертификат анализа генерируется очень реагенты в комплект таким образом гарантируя, что все компоненты набора были тщательно проверены для успеха клиента. Критические этапы рабочего процесса от начала до конца, представлены ниже:
Сотовые клонирования
Способность изолировать и расширение данной клеточной линии должны быть проверены перед началом любого ZFN экспериментов. Отдельные клетки должны быть изолированы и расширена, чтобы клонально производных населения возможно. Некоторые клетки линии непокорных в этом вопросе, и трюки, такие как обогащение редактировалось клонов, или культуры с условным СМИ могут помочь в преодолении этих проблем.
Доставка эффективность
Оптимизация доставки эффективности является обязательным до сдачи ZFNs. Многие методы могут быть использованы в том числе на основе липидов трансфекции, электропорации, и nucleofectiо. Идеальный метод доставки состоит из одного, что обеспечивает наиболее оптимальное сочетание эффективности доставки и выживаемости клеток. Количественного эти эффективность может быть оценена путем предоставления GFP контрольной плазмиды и количественного путем визуального осмотра или FACS 24-48 часов после родов.
Cel-I анализ
Крайне важно, чтобы Cel-I анализ проводится параллельно с соответствующим контролем, чтобы ПЦР, пищеварение и электрофорез параметров не будет вмешиваться в интерпретации эксперимента ZFN. Каждый комплект включает в себя контроль геномной ДНК, которые используются для создания Cel-I изображение в сертификате анализа. Усиление контроля с ДНК с праймерами при условии последующей Cel-I анализ позволит пользователям сравнить результаты, которые содержатся в сертификате анализа (COFA) изображение, и изолировать любую потенциальную неэффективность в этом плане эксперимента. Соответствующие отрицательного контроля, такие как макет, или GFP обработанной клеткиобразцы также должны быть включены, чтобы выяснение любого не конкретные продукты расщепления.
Качественный / Количественный анализ одно-клеточных клонов
После ZFN лечения и одного клонирования клетки, популяции клеток могут быть показаны для редактирования в локусе интерес целый ряд методов. Cel-я анализ может быть проведен на геномной ДНК из клонов с целью выявления кандидатов клоны для дальнейшего генотипирования. Важно, чтобы шип WT ПЦР ампликона в образец ампликонов в соотношении 1:1 перед выполнением Cel-я переварить как гомозиготных мутантных клонов будет содержать однородные молекулы, и, следовательно, передать отрицательное Cel-я анализа результатов. Альтернативный метод для скрининга этих кандидатов клонов проектировать одну ПЦР праймер посадку прямо на сайте целевой ZFN. Используется в сочетании с одной из управляющих грунтовки, отрицательный результат теста указывает потеря WT последовательности. Гетерозиготных клон, содержащий хотя бы одну WT аллели у,ield ПЦР сигнал, но могут быть полностью отделены от WT клонов выполнения ПЦР в контексте SYBR КПЦР.
Как только кандидат клонов были определены эти методы, они могут быть генотипировали стандартными пиросеквенирования, глубокое секвенирование, или другие методы секвенирования. Для всех методов секвенирования, ампликона создан из клональной геномной ДНК должны быть получены. Для традиционных аллелей пиросеквенирования могут быть отделены от TA-клонирования продуктов ПЦР и секвенирования отдельных колоний. Для таких методов, как глубоко последовательности этот шаг не является необходимым.
Гомология Режиссер Ремонт (HDR)
Этот протокол обеспечивает метод ZFN опосредованное нокаут гена через NHEJ. Интеграция трансгенов может быть проведено путем введения доноров плазмиды с оружием, что гомологии фланге сайт ZFN разреза. 11 В этом сценарии, созданные ZFN двухцепочечной разрыв ремонт HDR вместо NHEJ. HDR направленных яntegration трансгенов может быть подтверждена с помощью подобных методов к процедурам, предусмотренным в настоящем протоколе.
Поиск и устранение неисправностей
Доставка ZFNs
Доставка ZFN и выражения доставки можно управлять для поставкой GFP или другие подобные плазмиды для визуализации и / или количественный. Низкий выражение в связи с несовместимостью с промоутером типа клеток интерес может быть преодолена путем доставки ZFNs в мРНК формате. Кроме того, методом холодного шока могут быть использованы для дальнейшего повышения эффективности ZFNs в клетках. 12 Если мРНК используется крайне важно, чтобы клетки промывают до родов, чтобы обеспечить все сыворотки производных РНКазы были удалены. Разумно также таять мРНК на льду, и добавить его к клеткам в самый последний момент, чтобы свести к минимуму любую возможность для деградации.
Cel-I анализ
Основой Cel-я ассау есть конкретные и достаточно усиления локус интерес. Если не конкретные продукты усиление наблюдается использовать стандартные ПЦР устранения неисправностей увеличения специфичности, таких как оптимизация количества шаблонов, грунтовки концентрации, и езда на велосипеде параметров. Выполните PAGE анализ в отличие от стандартных электрофореза в агарозном как последний метод не обеспечивает адекватного разрешения и чувствительности. Cel-я дайджест условия могут быть оптимизированы, если не переваривается продукт или чрезмерное размытие не наблюдается. Титрование суммы Cel-1 нуклеазы и / или длина пищеварения время можно титровать, чтобы улучшить эти аспекты.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
| GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Kim, Y. G. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).
- Urnov, F. D. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Meyer, M. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).
- Geurts, A. M. Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Meng, X. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).
- Young, J. J. Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Wanatabe, M. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).
- Santiago, Y. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Lui, P. Q. Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Doyon, Y. Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption. Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).
