Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)
Summary
De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.
Abstract
Genoom bewerken is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om genfunctie en de genetische basis van ziekte te verduidelijken. Traditionele gen het bewerken van methoden, zoals de chemische-based mutagenese of random integratie van DNA-sequenties kennen willekeurige genetische veranderingen in een algemeen inefficiënte manier en vereisen integratie van ongewenste synthetische sequenties of het gebruik van afwijkende cultuur voorwaarden, mogelijk verwarrende biologische studie. Daarentegen kan kortstondige ZFN expressie in een cel het nauwkeurig, erfelijke gen bewerking op zeer efficiënte wijze zonder toediening van stoffen of integratie van synthetische transgenen.
Zinkvinger nucleasen (ZFNs) zijn enzymen die binden en snijd verschillende sequenties van dubbelstrengs DNA (dsDNA). Een functionele CompoZr ZFN unit bestaat uit twee individuele monomere proteïnen die een DNA "half-site" binden van ongeveer 15 tot 18 nucleotiden (zie figuur 1). Wanneer twee ZFN monoMers "home" om hun aangrenzende doelsites het DNA-splitsing domeinen dimeriseren en maak een dubbelstrengs breuken (DSB) in het DNA. 1 Inleiding van ZFN-gemedieerde DSB's in het genoom legt een basis voor zeer efficiënte genoom bewerken. Imperfect reparatie van DSB's in een cel via de niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA-reparatie-traject kan leiden tot kleine inserties en deleties (indels). Instelling van indels in het gen coderende sequentie van een cel kan leiden tot frameshift en vervolgens functionele knockout van een locus met genen hoog rendement. 2 Hoewel dit protocol beschrijft het gebruik van ZFNs een knockout maken integratie van transgenen ook via homologie-gericht reparatie bij de ZFN cut site.
De CompoZr Custom ZFN service staat voor een systematische, uitgebreide en goed gekarakteriseerde aanpak voor gerichte gen-editing voor de wetenschappelijke gemeenschap met ZFN technologie. Sigma wetenschappers werken nauw samen met onderzoekers op 1) perform due diligence-onderzoek met inbegrip van analyse van relevante structuur van genen, biologie en model systeem op grond van de projectdoelen, 2) toepassing van deze kennis op een goede targeting strategie, 3 te ontwikkelen), dan ontwerpen, bouwen, en functioneel ZFNs te valideren voor de activiteit in een relevante cellijn. De onderzoeker ontvangt positieve controle genomisch DNA primers en klaar voor gebruik ZFN reagentia geleverd zowel plasmide DNA in vitro getranscribeerde mRNA formaat. Deze reagentia kunnen vervolgens worden geleverd voor transiënte expressie in de cel van de onderzoeker lijn of celtype van de keuze. Monsters worden vervolgens getest gen bewerking op de plaats van belang door standaard moleculair-biologische technieken zoals PCR amplificatie, enzymatische digest en elektroforese. Na een positief signaal voor gen-bewerking wordt gedetecteerd in de oorspronkelijke populatie, cellen zijn eencellige gekloond en gegenotypeerd voor de identificatie van mutant klonen / allelen.
Protocol
Discussion
Zodra ZFN-gemodificeerde cellen worden geïsoleerd ze permanent te hebben en erfelijke DNA-wijzigingen. Dit resulteert in het vermogen om stabiel gemodificeerde cellijnen of ras dieren gewenste genetische modificaties genereren onderzoek. CompoZr maat ZFNs een stevige werkwijze voor genoom bewerking in een grote verscheidenheid van celtypen. Publicatie van de succesvolle genoom bewerken met ZFNs omvat, maar is niet beperkt tot menselijke cellijnen, muis, rat, zebravis, kikker, varkens en CHO onderzoeksmodellen. 3,4,5,6,7,8,9 De mogelijkheid om een te creëren dubbelstrengs onderbreking op de gewenste doelgebied in het opgegeven celtype wordt gegarandeerd wanneer de ZFNs goed geleverd in een cel. Het is ook mogelijk om sequentiële zinkvinger wijzigingen uit te voeren om een cel in om meer dan een genetische modificatie hebben binnen een cel. 10 De mogelijkheid om een specifieke doelgroep volgorde te selecteren en alleen te wijzigen dat bepaalde locus is een primaire oorzaak voor de mogelijkheid om meerdere te creëren modificatieskationen.
De CompoZr Custom ZFN certificaat van analyse wordt gegenereerd met de zeer reagentia die in de kit dus zorgen dat alle componenten van de kit grondig zijn gevalideerd voor succes van de klant. Kritische stappen van de workflow van begin tot eind worden hieronder weergegeven:
Cell klonen
De mogelijkheid om te isoleren en uit te breiden een bepaalde cellijn moet worden getest voor het begin van elke ZFN experimenten. Enkele cellen worden geïsoleerd en uitgebreid zodat een klonaal afgeleide populatie mogelijk is. Sommige cellijnen zijn recalcitrante in deze kwestie, en trucs, zoals verrijking voor bewerkte klonen, of cultuur met geconditioneerde media kan helpen om deze uitdagingen te overwinnen.
Levering efficiëntie
Optimalisatie van levering efficiëntie is een must voor de levering van de ZFNs. Vele werkwijzen kunnen worden toegepast met inbegrip lipide gebaseerde transfectiesystemen, elektroporatie en nucleofectiop. De ideale levering methode bestaat uit een die de meest optimale mix van levering efficiëntie en de overleving van de cel biedt. Kwantificeren van deze efficiëntie kan worden geschat door het leveren van een GFP controle plasmide en kwantificeren door visuele inspectie of FACS 24-48u na de levering.
Cel-I bepaling
Het is noodzakelijk dat Cel-I test wordt uitgevoerd in parallel met de nodige controles om ervoor te zorgen dat de PCR, de spijsvertering, en elektroforese parameters niet zal bemoeien met de interpretatie van ZFN experiment. Elk pakket omvat de controle genomisch DNA dat wordt gebruikt om de Cel-I beeld in het certificaat van onderzoek te creëren. Versterking van de controle-DNA met de meegeleverde primers, gevolgd door Cel-I-test kan de gebruiker om de resultaten te vergelijken met die welke in de Certificate of Analysis (BvL) beeld, en isoleer eventuele inefficiënties in dit aspect van een experiment. Een passende negatieve controle, zoals een mock, of GFP behandeld celmonster mogelijk te toelichting van een niet-specifieke splitsing mogelijk te maken.
Kwalitatieve / Kwantitatieve analyse van single-cell klonen
Na ZFN behandeling cel klonen kunnen populaties van cellen worden gescreend voor het bewerken van de locus van belang door een aantal methoden. Cel-I bepaling kan worden uitgevoerd op genomisch DNA van klonen voor het identificeren van kandidaat-klonen voor verdere genotypering. Het is belangrijk spike WT PCR amplicon in het monster amplicons een 1:1 verhouding voordat de Cel-I verteren als homozygote mutant klonen bevatten homogene moleculen, dus brengen negatieve Cel-I assay resultaat. Een alternatieve methode voor het screenen van deze kandidaat klonen een PCR primer landing ontwerpen rechtstreeks op de ZFN doelplaats. In combinatie met een van de besturingszones primers, een negatieve test resultaat geeft verlies van WT sequentie. Een heterozygote kloon die ten minste een allel WT ygewasopbrengst PCR-signaal, maar kan worden gescheiden van volledig WT klonen door het uitvoeren van de PCR in het kader van SYBR qPCR.
Zodra kandidaat klonen zijn geïdentificeerd door de bovenstaande werkwijzen, kunnen zij worden getypeerd door standaard pyrosequencing, diepe sequencing of andere sequentie methoden. Voor sequentie methoden moet een amplicon gemaakt van de genomische DNA klonen gegenereerd. Voor traditionele pyrosequencing allelen kan worden gescheiden door TA-klonen van de PCR-product, en de volgorde van de individuele kolonies. Voor de methoden zoals diep sequentie deze stap is niet nodig.
Homologie Directed Repair (HDR)
Dit protocol biedt de methode voor ZFN gemedieerde gen knock-out via NHEJ. De integratie van transgenen kan ook worden uitgevoerd door invoering van een donor plasmide met homologie armen die flank een ZFN cut site. 11 In dit scenario, de ZFN gemaakt dubbelstrengs breuk wordt hersteld door HDR in plaats van NHEJ. HDR gericht integration van transgenen kan worden bevestigd met vergelijkbare methoden om de procedures die in dit protocol.
Problemen oplossen
Levering van ZFNs
ZFN levering en expressie-levering kan worden gecontroleerd door levering van een GFP of andere dergelijke plasmide voor visualisatie en / of kwantificering. Lage expressie door promoter onverenigbaarheid met het celtype van belang kunnen worden overwonnen door aflevering van ZFNs in mRNA formaat. Bovendien kan de koude schokmethode worden gebruikt om verdere verhoging van de effectiviteit van ZFNs in cellen. MRNA 12 Als wordt gebruikt is het noodzakelijk dat cellen voor gewassen te leveren zodat alle serum-afgeleid RNAses zijn verwijderd. Ook is het goed de mRNA op ijs ontdooien en de toe te voegen aan de cellen op het laatste moment een kans op aantasting minimaliseren.
Cel-I bepaling
De oprichting van de Cel-I ASSAy is specifiek en voldoende versterking van het locus van belang. Als niet-specifieke amplificatie producten worden waargenomen gebruik maken van standaard PCR het oplossen van problemen om de specificiteit zoals de optimalisering van template bedrag, primer concentratie, en fietsen parameters te verhogen. Voer PAGE analyse tegenover standaard agarose electroforese deze methode niet voldoende resolutie en de gevoeligheid. Cel-I digest voorwaarden kan ook worden geoptimaliseerd als er geen verteerd product of overmatig smeren wordt waargenomen. Titratie van de hoeveelheid Cel-1 nuclease en / of lengte van de spijsvertering tijd kan worden getitreerd om deze aspecten te verbeteren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
| GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Kim, Y. G. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).
- Urnov, F. D. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Meyer, M. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).
- Geurts, A. M. Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Meng, X. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).
- Young, J. J. Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
- Wanatabe, M. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).
- Santiago, Y. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Lui, P. Q. Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Doyon, Y. Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption. Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).
