Basit Fare İntrakranial Xenograftlarında Çalışmaları Kılavuzu Vida Yöntemi

1. Hücre dizileri U87MG glioma hücrelerinin% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ile büyük doku kültürü şişeleri kültür. Hücreler şişeler sıcak Fosfat ile iki kez yıkanarak hasat Tamponlu Salin (PBS) ve 37 ° kuluçka ° C,% 0.25 'lik tripsin ve% 0.05 EDTA içeren 10 ml PBS ile 5 dakika. Bir kez hücreleri içeren bir kültür ortamı ve santrifüj (4 dakika için 300 X g) 10 ml 50 ml tüp yerleştirilir kaldırılır. Yıkama sonrasında, hücrelerin 10 konsantrasyonda yeniden süspanse x 10 6 / ml ul 50.000 hücre / 5 bir aşılama için izin verilen kültür ortamı,. Hücreler intrakranial enjeksiyon kadar buz üzerinde tutulur. 2. Intrakranial Rehberi vida civatalama Bu prosedür, hücre enjeksiyonu öncesinde birkaç gün yapılabilir. Burada açıklanan tüm prosedürler katı steril koşullar altında yapılmaktadır. Fare (nu BALB / c / nu kadın, 5-6 hafta yaklaşık 18g), tanıtım amaçlı numaralı tartılır ve ketamin (100 mg / kg) ve ksilizin (5 mg karışımı intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile anesthetised / kg). Cilt iyot çözeltisi ile silinir ve küçük bir kesi (2-3 mm), orta hat ve interaural çizgi anterior sağ tarafı boyunca yapılır. Bu kafatasının koronal ve sagital sütür ortaya koyar. Bregma, bu iki sütür kavşakta konumlandırılmış. 2,5 mm lateral ve bregma anterior 1 mm bir noktadan sonra kılavuz vida giriş noktası işaretlenir. Bu nokta, doğrudan kaudat nükleus 1 yukarıda yer almaktadır . 1 x 1 mm derin delik dura kafatası yoluyla twist drill düzenlenen steril bir eli ile delinmiş. Dura içine kafatasları yüzeyinin altında 1.6 mm uzatacaktır sterilize kılavuz vida sonra bir tornavida ile delik içine cıvatalı kafatası (Şekil 1A) ile aynı hizada kadar. Steril bir stile veya vida kukla sonra açılması (Şekil 1B) kapatmak için kılavuz vida merkezi deliğe yerleştirilir. Yara Vetbond Doku Yapıştırıcı (n-butil siyanoakrilat) ve fareler ile kapatılır reversine bir intraperitoneal enjeksiyon (küçük hayvanlar) (0.1 ml / kg) ve analjezi carprofen (5 mg/kg/100 ul) verilmiştir. Fare sonra 20 dakika kadar sürebilir bir ısınma mat (36 ° C) kurtarmak için izin verilir. Tamamen bilinçli kadar Fare sık sık izlenir ve bu kurtarma süre içinde gözlenir. 3. İntrakranial hücresel engraftman Steril kelepçeli Hamilton şırınga, iğne ucu kılavuz vida çıkışı (Şekil 1B) altında genişletmek için sadece 2 mm iğne sağlayan küçük plastik bir halka uygulanarak hazırlanmıştır. Bu nedenle, son aşılama noktası kafatası yüzeyinden 3.5 mm altında. Dört gün kılavuz vida cerrahisi sonrası, farelerin yukarıdaki gibi tekrar anestezi (2.1) ve stile kaldırmak için kılavuz vida üzerinde küçük bir kesi yapılır. Kelepçeli Hamilton şırınga sonra 5 ul herhangi bir hava kabarcığı oluşturabilir veya yukarı çekmek için önlem alarak iyice karıştırılır hücrelerinin ile doludur. Şırınga perfüzyon pompa güvenli ve iğne kılavuz vidasını (Şekil 1C) eklenir. Hücreler daha sonra saatte 30 ul hızında infüze. Otomatik cihazları (Şekil 1D), sabit bir akış hızında bir kerede bize 10 hayvanlara enjekte etmek için izin verdi. Hücreler aynı zamanda kelepçeli hamilton şırınga kullanılarak elle enjekte edilebilir ya da alternatif şırınga, iğne ucu 2 mm kılavuz vida ötesine izin 3 mm koparılmış 200 ul pipet ucu tarafından kelepçeli olabilir. Enjeksiyonu sonra sürekli bir sabit hızda yapılmalıdır. Infüzyon tamamlandığında, şırınga dikkatlice çıkarılır ve stile kılavuz vida değiştirilir. Yara kapalı yapıştırılmış ve fareler (2.7) daha önce olduğu gibi kurtarma ilaçlar verilir ve bir ısınma mat kurtarmak için izin verilir. 4. Terapötik meydan okuma Dört gün U87MG hücre aşılama sonra, fare tartılır ve rastgele kontrol ve tedavi grupları ayrılmıştır. Tedavi grubunda AMG102 (PBS 100 ul 100 mikrogram) bir IP enjeksiyonu ise kontrol grubu, PBS (100 ul) bir-periton içi (IP) enjeksiyonu. Enjeksiyonlar, 14 gün boyunca her iki günde toplam 6 enjeksiyonları (Şekil 2) bir tekrarlanır. Son enjeksiyondan sonra, farelerin günlük olarak izlenmekte ve her ikinci gün tartılır. Farelerde ciddi nörolojik işlev bozuklukları (denge bozukluğu, felç), dehidratasyon, ya da% 10'dan fazla kilo kaybı ya da can çekişen gösterilecek başladığında, onlar insanca ötenazi uygulandı. Bu insani bir uç nokta gün sonra, Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kaydedildi. 5. Tedavi verimliliğinin değerlendirilmesi </p> GraphPad Yazılım, Windows için GraphPad Prism 4.03 San Diego Kaliforniya ABD, Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kullanılarak oluşturulan www.graphpad.com 3. Ölümler veya euthanizations son nokta olayları olarak işaretlenir ve 1 olarak puanlandı. Deneyin sonunda kurtuldum Hayvanlar olmayan olaylar olarak kaydedilir ve 0 olarak skorlandı. 6. Temsilcisi sonuçları: Kontrol hayvanların hücrelerinin ilk aşılama sonrası nörolojik bozukluğu ve kilo kaybı 23 gün belirtileri göstermeye başladı. Bu önemli ölçüde, 35 gün AMG102 tedavi grubunda ertelendi. Gerçekten de 35 günde,% 77 (n = 7 / 9), kontrol grubunda ötenazi olmuştu. Kaplan-Meier sağkalım eğrisi açıkça AMG102 tedavi (Şekil 3) yanıt sağkalım önemli bir artış göstermektedir. 70 gün, kontrol farelerin% 88,% 37 ile karşılaştırıldığında (n = 8 / 9) ötenazi olmuştu AMG102 tedavi edilen grupta (n = 3 / 8). Beyinleri histolojik analiz, kontrol grubunda ise tüm 9 hayvanlar gelişmiş tümörler sadece 3 8 AMG102 tedavi edilen farelerde (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında doğruladı. Şekil 1: Görüntü (A) doğrudan kaudat nükleus üstünde yer alan bir alanda konumlandırılmış intrakranial kılavuz vida gösterir. 2 mm iğne kılavuzu ötesine uzatır ve böylece hücreler kaudat nükleus içinde 3,5 mm enjekte edilir kelepçeli hamilton şırınga (hücreleri ile önceden yüklenmiş) sonra kılavuz vida içine yerleştirilir. Şırınga sonra bir stile (B) tarafından kaldırılır ve değiştirilir. Otomatik infüzyon cihazı (C) bir defada 10 hayvanlara enjekte edebilir. Simültane beş enjeksiyonları (D) burada gösterilir. Şekil 2: Şematik Çalışma protokolü. Hücreler, tedavi günde 4 başlamadan gün 0 enjekte edildi. Kontrol hayvanlar PBS (100 ul) IP enjeksiyon tedavi grubunda AMG102 (100 μg/100 ul) IP enjeksiyon alırken aldı. Bu enjeksiyonlar, 10 gün boyunca her ikinci gün verildi. Toplam 6 enjeksiyonları verildi. Hayvanlar daha sonra nörolojik ve fiziksel bozuklukları belirtileri açısından 70 gün süreyle takip edildi. Şekil 3: Kaplan-Meier sağkalım eğrisi kontrolü ve AMG102 tedavi edilen farelerde karşılaştırarak. Anlamlı sağkalım AMG102 (p = 0.005) tedavi sonrasında elde edildi. Şekil 4: koronal beyin bölümlerinin kontrol hayvanlarda tümör gelişimi (A) ve AMG102 tedavi hayvanlarda hiçbir beyin tümörü geliştirme (B) gösteren Microphotographs. Ölçek çubuğu 1 mm.