Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

1. Linee cellulari U87MG cellule di glioma sono coltivate in contenitori di grandi dimensioni coltura tissutale con DMEM-F12 integrato con 5% di siero fetale bovino (FBS). Le cellule vengono raccolte mediante lavaggio fiaschi due volte con fosfato caldo Soluzione salina tamponata (PBS) e l'incubazione a 37 ° C per 5 minuti con 10 ml di PBS contenente 0,25% tripsina e 0.05% EDTA. Una volta che le cellule sono alzata, sono posti in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di terreni di coltura e centrifugati (300 X g per 4 min). Dopo il lavaggio, le cellule sono risospese ad una concentrazione di 10 x 10 6 / ml in terreni di coltura, che ha consentito una inoculazione di 50.000 cellule / 5 microlitri. Le cellule sono tenuti in ghiaccio fino ad iniezione intracranica. 2. Guidavite intracranica bullonatura Questa procedura può essere effettuata alcuni giorni prima l'iniezione di cellule. Tutte le procedure qui descritte sono state effettuate sotto stretto condizioni sterili. Topi (BALB / c nu / nu femminile; 5-6 settimane, circa 18g) sono numerati a scopo di identificazione, pesati e anestetizzati con un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). La pelle è pulito con una soluzione di iodio e di una piccola incisione (2-3 mm) è realizzato lungo il lato destro della linea mediana e anteriore alla linea interaurale. Ciò espone le suture coronale e sagittale del cranio. Il bregma è posizionato alla confluenza di questi due punti di sutura. La vite di punto di ingresso guida viene poi segnato in un punto 2.5 mm lateralmente e 1 mm anteriormente al bregma. Questo punto si trova direttamente sopra il nucleo caudato 1. A x 1 1 foro mm di profondità si è esercitato con una mano sterile tenuta punta elicoidale attraverso il cranio alla dura. Una vite guida sterilizzato che si estenderà 1,6 millimetri sotto la superficie teschi in la dura viene quindi montata nel foro con un cacciavite fino a filo con il cranio (Figura 1A). Un mandrino sterili o manichino vite viene poi inserito nel foro centrale della vite guida per chiudere l'apertura (Figura 1B). La ferita è chiusa con adesivo tissutale Vetbond (n-butil-cianoacrilato) e il mouse sono un'iniezione intraperitoneale di reversine (piccoli animali) (0,1 ml / kg) e il carprofen (5 mg/kg/100 microlitri) per l'analgesia. I topi sono poi permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento (36 ° C) che possono accogliere fino a 20 minuti. I topi sono spesso monitorati e osservati durante questo periodo di recupero fino a quando non sono pienamente consapevoli. 3. Intracranica attecchimento cellulare Una siringa sterile ammanettato Hamilton è preparato mediante l'applicazione di un piccolo anello di plastica per la punta dell'ago consentendo solo 2 mm di estendere l'ago sotto la guida all'uscita della vite (Figura 1B). Il punto di inoculazione finale è quindi 3,5 millimetri sotto la superficie del cranio. Quattro giorni dopo l'intervento vite di guida, i topi sono di nuovo anestetizzati come sopra (2,1) e una piccola incisione è fatta sulla vite guida per rimuovere il mandrino. La siringa Hamilton ammanettato viene poi riempito con 5 ml di cellule in comune, tenendo bene le precauzioni per non creare o elaborare eventuali bolle d'aria. La siringa è fissata alla pompa di perfusione e l'ago viene inserito la vite di guida (Figura 1C). Le cellule sono poi infuse ad una velocità di 30 microlitri per ora. L'apparecchio automatico (Figura 1D) ci ha permesso di iniettare fino a 10 animali in un momento ad un flusso costante. Le cellule possono anche essere iniettato manualmente utilizzando la siringa ammanettato hamilton o in alternativa la siringa può essere ammanettato da una punta di 200 microlitri pipetta che è stato tagliato di 3 mm per consentire la punta dell'ago di estendere oltre la vite di guida da 2 mm. L'iniezione deve essere eseguita con un ritmo costante costante. Quando l'infusione è completa, la siringa è accuratamente rimosso e il mandrino è sostituito nella vite di guida. La ferita è incollato chiuso ei topi sono dati farmaci recupero come prima (2,7) e ha permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento. 4. Sfida terapeutica Quattro giorni dopo l'inoculazione di cellule U87MG, i topi sono pesati e divisi casualmente in gruppi di controllo e trattamento. Il gruppo di controllo è dato un intraperitoneale (IP) l'inserimento di PBS (100 l), mentre il gruppo di trattamento è dato una iniezione di AMG102 IP (100 mg in 100 ml di PBS). Le iniezioni vengono ripetute ogni due giorni per 14 giorni, per un totale di 6 iniezioni (Figura 2). Dopo l'ultima iniezione, i topi sono monitorati quotidianamente e pesati tutti i giorni secondo. Quando i topi cominciò a mostrare notevoli disfunzioni neurologiche (disturbi dell'equilibrio, paralisi), disidratazione, o perdita di peso superiore al 10% o moribondi, erano umanamente eutanasia. Questi umano end-point giorni sono stati poi registrati sulla curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza. 5. Valutazione di efficacia terapeutica </p> La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza è stata generata utilizzando GraphPad Prism 4.03 per Windows; Software GraphPad, San Diego California USA, www.graphpad.com 3. Euthanizations morti o sono stati contrassegnati come end-point eventi e segnato come 1. Gli animali che sono rimasti vivi alla fine di questo esperimento sono stati registrati come non-eventi e segnato come 0. 6. Rappresentante dei risultati: Animali di controllo ha iniziato a mostrare segni di disturbi neurologici e perdita di peso 23 giorni dopo l'inoculo iniziale di cellule. Questo è stato significativamente ritardato nel gruppo AMG102 trattati per 35 giorni. Infatti di giorno 35, il 77% (n = 7 / 9) del gruppo di controllo era stata eutanasia. La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza dimostra chiaramente l'aumento significativo della sopravvivenza in risposta al AMG102 trattamento (Figura 3). Dal giorno 70, l'88% dei topi di controllo era stata eutanasia (n = 8 / 9) rispetto al 37% (n = 3 / 8) di AMG102 gruppo trattato. L'analisi istologica del cervello hanno confermato che tutti i 9 gli animali del gruppo di controllo sviluppato tumori rispetto a solo 3 delle 8 AMG102 topi trattati (Figura 4). Figura 1: Immagine (A) mostra vite intracranica guida posizionato in una zona situata direttamente al di sopra del nucleo caudato. Il ammanettato hamilton siringa (pre-caricato con le cellule) viene poi inserito all'interno della vite guida in modo che 2 mm di aghi si estende oltre la guida e le cellule vengono iniettate 3,5 millimetri all'interno del nucleo caudato. La siringa viene poi rimosso e sostituito da uno stiletto (B). Il dispositivo di infusione automatica (C) può iniettare fino a 10 animali alla volta. Qui sono cinque iniezioni simultanee (D). Figura 2: Schema del protocollo di studio. Le cellule sono state iniettate al giorno 0 con il trattamento a partire dal giorno 4. Animali di controllo hanno ricevuto una iniezione di PBS (100 l) IP, mentre il gruppo di trattamento hanno ricevuto una iniezione di AMG102 (100 μg/100 microlitri) IP. Queste iniezioni sono state somministrate ogni secondo giorno per 10 giorni. Un totale di 6 iniezioni sono state eseguite. Gli animali sono poi stati monitorati per 70 giorni per eventuali segni di disturbi neurologici e fisici. Figura 3: curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza confronto controllo e AMG102 topi trattati. Sopravvivenza significativo è stato ottenuto dopo trattamento con AMG102 (p = 0,005). Figura 4: microfotografie di sezioni coronali del cervello dimostrando sviluppo di tumori negli animali di controllo (A) e non lo sviluppo del cervello tumore nel AMG102 animali trattati (B). Barra di scala è di 1 mm.