Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen
Summary
Um neue therapeutische Paradigmen für die Behandlung von Gliomen zu bewerten, sind physiologisch relevanten Modelle unerlässlich. Wir nutzen einen implantierbaren Führungsschraube Verfahren für die Einrichtung von intrakraniellen Xenograft-Modelle, schneller und sicherer als stereotaktische Ansätze ist.
Abstract
Die Transplantation von menschlichen Tumorzellen in das Gehirn von immunsupprimierten Mäusen ist eine etablierte Methode für die Untersuchung von Hirntumoren einschließlich Glioblastom (Gliom) und Medulloblastom. Die weit verbreitete stereotaktische Ansatz erlaubt nur für die Injektion von einem einzigen Tier zu einem Zeitpunkt, ist arbeitsintensiv und erfordert hochspezialisierte Geräte. Die Führungsschraube Methode, die ursprünglich von Lal et al., 1 entwickelt wurde entwickelt, um lästige stereotaktische Verfahren zu beseitigen. Wir beschreiben nun eine modifizierte Führungsschraube Ansatz, der eine schnelle und besonders sicher ist, welche beide kritische ethische Überlegungen. Bemerkenswert ist, unser Verfahren beinhaltet nun eine Infusionspumpe mit bis zu 10 Tiere gleichzeitig mit Tumorzellen injiziert werden.
Zur Demonstration der Nützlichkeit dieses Verfahrens haben wir Menschen U87MG Gliomzellen als intrakranielle Xenotransplantate in Mäusen, die dann mit AMG102 behandelt wurden, ein vollständig humaner Antikörper, der zur HGF / Scatter-Faktor derzeit in der klinischen Evaluation 2-5. Systemische Injektion von AMG102 signifikant das Überleben von allen Mäusen mit intrakraniellen U87MG Xenotransplantate verlängert und führte zu einer Reihe von kompletten Heilung.
Diese Studie zeigt, dass die Führungsschraube Methode ein kostengünstiges, hoch reproduzierbare Konzept für die Erarbeitung intrakraniellen Xenotransplantate ist. Darüber hinaus bietet es eine relevante physiologische Modell zur Validierung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Hirntumoren.
Protocol
Discussion
Die intrakranielle Führungsschraube hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Etablierung von intrakraniellen Xenotransplantate und in die Hände eines ausgebildeten Tier-Techniker, dieses Verfahren ist sehr einfach und ohne die Notwendigkeit eines stereotaktischen Gerät durchgeführt. Unsere Methode kombiniert die Verwendung einer Führungsschraube, um genau zu lokalisieren die Region des Gehirns am besten geeignet für in vivo Tumor-Entwicklung und eine automatisierte Infusionspumpe, die für die gleichzeitige Impfung von bis zu 10 Tiere auf einmal erlaubt. Die Führungsschraube Augmentation dauert weniger als 5 Minuten in Anspruch. Die automatisierte Infusion von Zellen bei 30 ul / h dauert nur 10 Minuten für eine 5 ul Volumen. Dies gewährleistet eine genaue Dosierung mit einer konstanten Rate und reduziert das Risiko der Zell-Ausstoß in die extrakraniellen Bereich aufgrund der erhöhten Hirndruck. Wir haben auch dieses Verfahren mit 10 ul durchgeführt und haben keine extra-kraniale Tumorwachstum durch zelluläre Rückfluss beobachtet. Da die automatisierten Infusionspumpe ermöglicht auch mehrere Tiere gleichzeitig geimpft werden wir spritzen bis zu 60 Tiere pro Stunde im Vergleich zu einem stereotaktischen Verfahren, das zu etwa 15 Tieren pro Stunde begrenzt ist.
Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die Lage des Führungsschraube in den Schädel als seine Position bestimmt der ultimative Ort der Tumormasse. Wenn die Führungsschraube ist zu zentral, die Zellen in einem Bereich zwischen den beiden Hirnhälften während, wenn die Führung zu weit nach vorne gebracht wird injiziert werden, werden die Zellen nicht in das Gehirn überhaupt injiziert werden. Es ist daher wichtig, so genau wie möglich bei der Suche nach der Führung 2,5 mm lateral und 1 mm anterior der Bregma 1. In dieser Studie verwendeten wir einen Stahl Führungsschraube, obwohl aus Kunststoff Führungsschrauben auch für diejenigen Studien, die Bildgebung des Gehirns, wie MRT oder PET 6 erfordern. Auch wenn die automatisierte Infusionspumpe ist unerschwinglich für einige Gruppen, können die Zellen noch manuell schneller als stereotaktische Ansätze injiziert werden. Insgesamt kann diese schnelle, genaue und reproduzierbare Methode zur Gliom, Medulloblastom und Hirnstamm Tumoren 7 zu studieren. Dieses Verfahren hat bereits über 500 Mäusen zwischen unseren beiden Labors mit Todesfällen aufgrund von unerwarteten Narkose Reaktionen (<1%) durchgeführt. Mäuse, die mit der Führung Schraube verschraubt wurden und anschließend infundiert mit Zellen nicht starben oder leiden alle neurologischen Komplikationen als Folge des Verfahrens. Tiere haben seit 100 Tagen ohne Komplikationen überstanden. Obwohl wir zu einer haarlosen Maus, einem immungeschwächten Maus mit Haaren wie die SCID verwenden bevorzugt wäre ebenso angemessen, sofern die Schädel Haar vor war es, die operativ entfernt, damit die Stelle sauber und die Haare stören Führungsschraube verhindern.
Es gibt mehrere neuartige Therapeutika derzeit für die Behandlung von Gliomen 8-10 entwickelt. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die subkutane U87MG Gliom Xenotransplantate durch Behandlung mit AMG102 3 kann verhindert werden, ein humanisierter Antikörper, der zur HGF derzeit in der klinischen Evaluierung in Gliom 5. Wir verwendeten die Methode hier beschreiben, intrakranielle U87MG Tumoren im Gehirn von Nacktmäusen zu etablieren. Unsere Studie zeigt deutlich den Nutzen der Methode und zeigt, dass AMG102 deutlich hemmt das Wachstum von orthotopen U87MG Xenotransplantate. Wir werden auch weiterhin dieses Modell verwenden, um festzustellen, was andere Therapeutika in Kombination mit AMG102 verwendet werden, um effektivere Hemmung des Tumorwachstums zu erhalten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Verlene Henry und Lindsay Holmes um Hilfe danke in der Entwicklung dieses Modells. Diese Arbeit wurde teilweise durch die James S. McDonnell Foundation (# 220020173) finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
- Lal, S. An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals. J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).
- Jun, H. T. AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts. Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).
- Pillay, V. The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases. Neoplasia. 11, 448-458 (2009).
- Buchanan, I. M. Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102. J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).
- Wen, P. Y. A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma. Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).
- Caretti, V. Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model. Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).
- Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization. Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).
- Johns, T. G. The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization. Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).
- Scott, A. M. A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).
- Niyazi, M. Therapeutic options for recurrent malignant glioma. Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).
