Простой метод Винт Руководство по Внутричерепное ксенотрансплантата Исследования на мышах

1. Клеточные линии U87MG глиомы клетки культивируют в больших тканевых культур колбы с DMEM-F12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Клетки собирали стиральной колбы дважды с теплым фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубации их при 37 ° С в течение 5 минут с 10 мл PBS, содержащем 0,25 трипсина% и 0,05% ЭДТА. Как только клетки поднимаются, они помещаются в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл питательной среды и центрифугировали (300 X г в течение 4 мин). После мытья, клетки ресуспендировали в концентрации 10 х 10 6 / мл в культуре средств массовой информации, что позволило прививки 50 000 клеток / мкл 5. Клетки хранятся на льду до внутричерепных инъекций. 2. Руководство винта внутричерепное болтов Эта процедура может быть проведена за несколько дней до введения клеток. Все процедуры, описанные здесь были проведены под строгим стерильных условиях. Мыши (BALB / с ню / ню женщины; 5-6 недель, и примерно 18 г) пронумерованы в целях идентификации, взвешивают и anesthetised с внутрибрюшинно (IP) инъекция смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг). Кожа протирать с раствором йода и маленький разрез (2-3 мм) производится по правой стороне от средней линии и впереди interaural линии. Это подвергает корональной и сагиттальной швов черепа. Брегмы расположена на стыке этих двух швов. Вступления руководство винт точка затем отмечено в точке 2,5 мм боковые и 1 мм впереди брегмы. Эта точка находится прямо над хвостатого ядра 1. 1 х 1 мм в глубину отверстия сверлят с стерильных ручной поворот просверлить череп оболочки. Стерилизовать винт руководство, которое будет распространяться 1,6 мм ниже поверхности черепа в оболочку, затем ринулся в отверстие с помощью отвертки, пока на одном уровне с черепом (рис. 1А). Стерильные стилет или винт манекен затем помещается в центральное отверстие направляющей винт, чтобы закрыть отверстие (рис. 1В). Рана закрыта с Vetbond клей ткани (н-бутил цианоакрилат) и мышей приведены внутрибрюшинного введения reversine (мелкие животные) (0,1 мл / кг) и carprofen (5 mg/kg/100 мкл) для обезболивания. Мыши затем позволили восстановить на потепление мат (36 ° C), которая может занять до 20 минут. Мыши часто контролируется и наблюдается в течение этого времени на восстановление, пока они не в полном сознании. 3. Внутричерепное сотовой приживления Стерильный шприц манжетами Хэмилтон готовится с применением небольшого кольца до кончика иглы, допуская только 2 мм иглой расширить ниже розетки руководство винт (рис. 1В). Конечная точка прививки, следовательно, 3,5 мм ниже поверхности черепа. Через четыре дня после операции винт руководства, мышей снова под наркозом, что и выше (2,1) и небольшой разрез делается над руководство винт для удаления стилет. Манжетами шприц Гамильтон затем заполняется 5 мкл и смешанных ячеек принимать меры предосторожности, чтобы не создавать или составлять любые воздушные пузыри. Шприц крепится к перфузии насос и игла вводится в винт руководство (рис. 1в). Затем клетки переплетаются в размере 30 мкл в час. Автоматизированные аппараты (рис. 1D) позволило нам внедрить до 10 животных одновременно с постоянной скоростью потока. Клетки могут также быть введены вручную с помощью шприца Hamilton манжетами или же шприц можно манжетами по 200 мкл кончика пипетки, которые были сокращены на 3 мм, чтобы кончик иглы выходить за рамки руководства винт на 2 мм. Инъекция должна быть выполнена на постоянном устойчивыми темпами. Когда настой будет завершена, шприц, тщательно удалены и заменены стилет в руководстве винт. Рана клееного закрыты и мышей приведены восстановления лекарства как и раньше (2.7) и позволил восстановить на потепление мат. 4. Терапевтические проблемы Через четыре дня после прививки U87MG клетки, мышей взвешивали и случайным образом разделены на контроль и лечение групп. Контрольную группу дано внутри-перитонеального (IP), инъекции PBS (100 мкл), в то время как лечение группе задается IP-инъекция AMG102 (100 мкг в 100 мкл PBS). Инъекции повторяются каждый второй день в течение 14 дней, всего 6 инъекций (рис. 2). После последней инъекции, мышей контролируется на ежедневной основе и весил каждый второй день. Когда мыши стали проявлять значительную неврологических нарушений (нарушение баланса, паралич), обезвоживание, или более чем на 10% потери веса или умирающим, они были гуманно euthanised. Эти гуманные конечной точки дней затем были записаны на выживаемости Каплана-Мейера кривой. 5. Оценка терапевтической эффективности </p> Выживаемости Каплана-Мейера кривая была создана с использованием GraphPad Призма 4,03 для Windows; GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com 3. Смертей или euthanizations были отмечены как конечная точка события и забил как 1. Животные, которые остались живы в конце эксперимента были зарегистрированы как не-события и забил как 0. 6. Представитель результаты: Контрольные животные стали проявлять признаки неврологических нарушений и потерю веса 23 дней после первой прививки клеток. Это было значительно задерживается в AMG102 группе терапии до 35 дней. Действительно, по 35-й день, 77% (п = 7 / 9) в контрольной группе были умерщвлены. Выживаемости Каплана-Мейера кривой наглядно демонстрирует значительное увеличение выживаемости в ответ на AMG102 лечения (рис. 3). Днем 70, 88% контрольных мышей были умерщвлены (п = 8 / 9) по сравнению с 37% (п = 3 / 8) из AMG102 группе терапии. Гистологический анализ мозга подтвердило, что все 9 животных в контрольной группе, развились опухоли по сравнению с только 3 из 8 AMG102 мышей (рис. 4). Рисунок 1: Image () показывает, внутричерепное винт руководства расположены в районе, расположенном непосредственно над хвостатого ядра. Манжетами Гамильтон шприц (с предустановленной клетки) помещают внутрь руководство винт так, чтобы 2 мм игла выходит за рамки руководства и клетки вводят 3,5 мм внутри хвостатого ядра. Шприц позже удален и заменен стилет (B). Автомат инфузии (C) может внедрить до 10 животных одновременно. Здесь показаны пяти одновременных инъекций (D). Рисунок 2: Схема протокола исследования. Клетки вводили в день 0 лечения начиная с 4-й день. Контрольные животные получали инъекции PBS (100 мкл) IP в то время как лечение группа получала инъекции AMG102 (100 μg/100 мкл) IP. Эти инъекции были даны каждый второй день в течение 10 дней. Всего 6 инъекций дали. Животные были тогда мониторинг в течение 70 дней признаки неврологических и физических нарушений. Рисунок 3: Каплан-Майера выживания кривой сравнения контроля и AMG102 мышей. Значительные выживания была получена после лечения AMG102 (р = 0,005). Рисунок 4: Микрофотографии корональные разделы мозга демонстрирующие развитие опухоли у контрольных животных (А) и не опухоль головного мозга развития в AMG102 подопытных животных (B). Шкала бар 1 мм.