Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

1. Les lignées cellulaires U87MG cellules de gliome sont cultivées dans de grands flacons de culture tissulaire avec du DMEM-F12 supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal (FBS). Les cellules sont récoltées par les flacons de lavage à deux reprises avec du phosphate chaude saline tamponnée (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant 5 minutes avec 10 ml de PBS contenant 0,25% de trypsine et 0,05% d'EDTA. Une fois que les cellules sont levées, elles sont placées dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de milieux de culture et centrifugés (300 X g pendant 4 min). Après le lavage, les cellules sont resuspendues à une concentration de 10 x 10 6 / ml dans les milieux de culture, ce qui a permis pour un ensemencement de 50.000 cellules / 5 pl. Les cellules sont conservées dans la glace jusqu'à l'injection intracrânienne. 2. Guide à vis intracrânienne boulonnage Cette procédure peut être effectuée plusieurs jours avant l'injection des cellules. Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées dans le cadre stricte des conditions stériles. Souris (BALB / c nu / nu féminin; 5-6 semaines, environ 18g) sont numérotées à des fins d'identification, pesés et anesthésiés avec un intrapéritonéale (IP) par injection d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg). La peau est essuyé avec une solution d'iode et d'une petite incision (2-3 mm) se fait le long du côté droit de la ligne médiane et antérieure à la ligne interaural. Cette situation expose les points de suture coronale et sagittale du crâne. Le bregma est positionné à la jonction de ces deux points de suture. Le point d'entrée Guide vis est ensuite marqué à un point de 2,5 mm latéral et 1 mm antérieure au bregma. Ce point est situé directement au-dessus du noyau caudé 1. Un trou de 1 x 1 mm de profondeur est percé avec une main stériles maintenues foret à travers le crâne de la mère. Une vis de guidage stérilisés qui s'étendra de 1,6 mm sous la surface des crânes dans la dure-mère est ensuite boulonné dans le trou avec un tournevis jusqu'à ce ras du crâne (figure 1A). Un stylet stérile ou factices vis est ensuite placé dans le trou central de la vis de guide pour fermer l'ouverture (figure 1B). La plaie est fermée avec une colle tissulaire Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) et les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de reversine (petits animaux) (0,1 ml / kg) et carprofène (5 mg/kg/100 ul) pour l'analgésie. Les souris sont ensuite autorisés à récupérer sur un tapis de réchauffement (36 ° C) qui peut prendre jusqu'à 20 minutes. Les souris sont fréquemment suivis et observés pendant ce temps de récupération jusqu'à ce qu'ils soient pleinement conscients. 3. Intracrânienne greffe cellulaire Une seringue stérile menottées Hamilton est préparé en appliquant un petit anneau en plastique à la pointe de l'aiguille permettant seulement 2 mm de l'aiguille de prolonger en dessous de la sortie de la vis de guidage (figure 1B). Le point d'inoculation final est donc de 3,5 mm en dessous de la surface du crâne. Quatre jours après la chirurgie vis de guidage, les souris sont à nouveau anesthésiés comme ci-dessus (2,1) et une petite incision est faite sur la vis de guidage pour retirer le stylet. La seringue menottées Hamilton est ensuite rempli avec 5 pi de bien prendre cellules mixtes précautions pour ne pas créer ou établir les bulles d'air. La seringue est fixé à la pompe de perfusion et de l'aiguille est insérée dans la vis de guidage (figure 1C). Les cellules sont ensuite infusé à un taux de 30 ul par heure. L'appareil automatisé (figure 1D) nous a permis d'injecter jusqu'à 10 animaux en même temps à un débit constant. Les cellules peuvent également être injectés manuellement en utilisant la seringue Hamilton menottées ou bien la seringue peut être menotté par une pointe de pipette 200 ul qui a été coupé par 3 mm pour permettre à la pointe de l'aiguille au-delà de la vis de guidage par 2 mm. L'injection doit alors être effectuée à un rythme constant stable. Lorsque la perfusion est terminée, la seringue est soigneusement enlevé et le stylet est remplacé dans la vis guide. La plaie est fermée collés et les souris sont donnés des médicaments de récupération comme avant (2,7) et a permis de récupérer sur un tapis de réchauffement. 4. Défi thérapeutique Quatre jours après l'inoculation des cellules U87MG, les souris sont pesés et divisés au hasard en groupes de contrôle et de traitement. Le groupe de contrôle est donné une intra-péritonéale (IP) d'injection de PBS (100 pl), tandis que le groupe de traitement est donné une injection IP de AMG102 (100 ug dans 100 ul de PBS). Les injections sont répétées tous les deux jours pendant 14 jours, un total de 6 injections (figure 2). Après la dernière injection, les souris sont contrôlés quotidiennement et pesé tous les deux jours. Lorsque les souris ont commencé à afficher significative des dysfonctionnements neurologiques (troubles de l'équilibre, paralysie), la déshydratation, ou perte de poids de plus de 10% ou moribonds, ils étaient humainement euthanasiés. Ces humaine point final jours ont ensuite été enregistrées sur la courbe de survie de Kaplan-Meier. 5. Evaluation de l'efficacité thérapeutique </p> La courbe de survie de Kaplan-Meier a été généré en utilisant GraphPad Prism 4.03 pour Windows; GraphPad Software, San Diego, en Californie Etats-Unis, www.graphpad.com 3. Décès ou euthanizations étaient marqués comme point final des événements et un score de 1. Les animaux qui ont survécu à la fin de l'expérience ont été enregistrées comme non-événements et notée 0. 6. Les résultats représentatifs: Les animaux témoins ont commencé à montrer des signes de troubles neurologiques et la perte de poids 23 jours après l'inoculation initiale des cellules. Cela a été considérablement retardé dans le groupe traité AMG102 à 35 jours. En effet en 35 jours, 77% (n = 7 / 9) du groupe de contrôle avaient été euthanasiés. La courbe de survie de Kaplan-Meier démontre clairement l'augmentation significative de la survie en réponse à AMG102 traitement (figure 3). En 70 jours, 88% des souris témoins ont été euthanasiés (n = 8 / 9), comparativement à 37% (n = 3 / 8) des AMG102 groupe traité. L'analyse histologique des cerveaux a confirmé que tous les 9 animaux du groupe contrôle ont développé des tumeurs, comparativement à seulement 3 des 8 AMG102 souris traitées (figure 4). Figure 1: Image (A) montre vis de guidage intracrânienne positionné dans une zone située directement au-dessus du noyau caudé. Le revers seringue Hamilton (pré-chargé avec des cellules) est alors placé à l'intérieur de la vis guider afin que l'aiguille de 2 mm d's'étend au-delà du guide et les cellules sont injectées de 3,5 mm à l'intérieur du noyau caudé. La seringue est ensuite retiré et remplacé par un stylet (B). Le dispositif de perfusion automatique (C) peut injecter jusqu'à 10 animaux à la fois. On voit ici cinq injections simultanées (D). Figure 2: Schéma du protocole de l'étude. Les cellules ont été injectées au jour 0 avec un traitement à compter du jour 4. Les animaux témoins ont reçu une injection de PBS (100 pl) IP alors que le groupe de traitement ont reçu une injection de AMG102 (100 ug/100 ul) IP. Ces injections ont été réalisées tous les deux jours pendant 10 jours. Un total de 6 injections ont été administrées. Les animaux ont ensuite suivis pendant 70 jours des signes de troubles neurologiques et physiques. Figure 3: courbe de survie de Kaplan-Meier comparant le contrôle et AMG102 souris traitées. Significative de la survie a été obtenue après un traitement par AMG102 (p = 0,005). Figure 4: microphotographies de coupes de cerveau coronale montrant le développement de tumeurs chez les animaux témoins (A) et pas de développement de tumeurs cérébrales dans le AMG102 animaux traités (B). La barre d'échelle est de 1 mm.