برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران
Summary
من أجل تقييم نماذج علاجية جديدة لعلاج دبقي ، والنماذج ذات الصلة الفيزيولوجية ضرورية. نحن الاستعانة بهيئة المسمار دليل زرع الداخلي لإنشاء نماذج طعم أجنبي داخل القحف أن أكثر سرعة وأكثر أمانا من النهج المجسم.
Abstract
لتطعيم الخلايا السرطانية البشرية في دماغ الفئران كبت المناعة وسيلة أنشئت لدراسة سرطان الدماغ بما في ذلك ورم أرومي دبقي (دبقي) ونخاعي. نهج المجسم على نطاق واسع يسمح فقط للحقن حيوان واحد في وقت واحد ، هو العمل المكثف ويتطلب معدات متخصصة للغاية. وقد وضعت المسمار دليل الأسلوب ، وضعت في البداية من قبل لال وآخرون ، من 1 إلى القضاء على المجسم إجراءات مرهقة. نحن الآن في وصف المسمار دليل تعديل النهج الذي هو سريع وآمنة على نحو استثنائي ؛ وكلاهما الاعتبارات الأخلاقية الحرجة. على وجه الخصوص ، تتضمن إجراء لدينا الآن مضخة التسريب الذي يسمح تصل إلى 10 الحيوانات ليتم حقنه في نفس الوقت مع الخلايا السرطانية.
للتدليل على فائدة هذا الإجراء ، أنشأنا خلايا دبقي U87MG كما xenografts داخل القحف في الفئران التي عولجت بعد ذلك مع AMG102 ؛ وهو جسم الإنسان كاملا الموجهة إلى HGF / عامل مبعثر يخضع حاليا لتقييم السريرية 2-5. الحقن المنتظم للAMG102 مطولة بشكل كبير في بقاء جميع الفئران مع xenografts U87MG داخل القحف ، وأسفرت عن عدد من العلاجات كاملة.
هذه الدراسة تبين أن المسمار دليل الأسلوب هو غير مكلفة ، والنهج استنساخه للغاية لإنشاء xenografts داخل القحف. وعلاوة على ذلك ، فإنه يوفر نموذجا الفسيولوجية ذات الصلة للتحقق من صحة الرواية الاستراتيجيات العلاجية لعلاج سرطان المخ.
Protocol
Discussion
المسمار داخل القحف دليل الأسلوب المعروضة هنا يمكن إنشاء السريع واستنساخه من داخل الجمجمة وxenografts في أيدي أحد الفنيين المدربين الحيوانية ، وبسهولة جدا تنفيذ هذا الإجراء من دون الحاجة لجهاز المجسم. لدينا أسلوب يجمع بين استخدام المسمار دليل ، لتحديد دقيق لمنطقة الدماغ الأكثر ملاءمة لتطوير ورم في الجسم الحي ، ومضخة حقن الآلي التي تسمح للتلقيح في وقت واحد تصل إلى 10 حيوانات في وقت واحد. والتعزيز الداخلي المسمار دليل تستغرق أقل من 5 دقائق لأداء. ضخ الآلي من الخلايا في 30 ميكرولتر / ساعة يستغرق سوى 10 دقيقة لحجم 5 ميكرولتر. هذا يضمن جرعات دقيقة بمعدل ثابت ، ويقلل من خطر الطرد من الخلية إلى منطقة خارج الجمجمة بسبب زيادة الضغط داخل الجمجمة. لقد قمنا أيضا هذا الإجراء مع 10 مجلدات ميكرولتر ولم يلاحظ أي نمو الورم خارج الجمجمة بسبب ارتداد الخلوية. كما مضخة التسريب الآلي كما يسمح بالحصول على تلقيح الحيوانات عدة في وقت واحد يمكننا ضخ ما يصل الى 60 ساعة في الحيوانات مقارنة المجسم الداخلي الذي يقتصر على الحيوانات ما يقرب من 15 ساعة.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو موقع دليل المسمار في الجمجمة حيث يحدد موقفه النهائي من الموقع الجزء الأكبر الورم. إذا كان الدليل هو المسمار المركزي للغاية ، وسوف يتم حقن الخلايا في المنطقة بين نصفي الدماغ two حين إذا تم وضع دليل للقدما بعيدا ، لن يتم حقن الخلايا في الدماغ على الإطلاق. ولهذا من الضروري أن تكون دقيقة قدر الإمكان في تحديد مكان وجود دليل 2.5 مم و 1 مم الوحشي الأمامي للbregma 1. في هذه الدراسة استخدمت لدينا دليل المسمار الصلب ، وعلى الرغم من مسامير دليل البلاستيك وتتوفر أيضا لتلك التي تتطلب دراسات تصوير الدماغ مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو PET 6. حتى لو كلف مضخة التسريب الآلي باهظة بالنسبة لبعض الجماعات ، لا يزال يتم حقن الخلايا يدويا بسرعة أكبر من النهج المجسم. عموما ، يمكن استخدام هذه السريع ، وطريقة دقيقة وقابلة للتكرار لدراسة دبقي ، نخاعي وأورام جذع الدماغ 7. وقد تم تنفيذ هذا الإجراء على أكثر من 500 فئران المختبرات بين بلدينا مع الوفيات الناجمة عن ردود الفعل غير متوقعة مخدر (<1 ٪). وكانت الفئران التي انسحب مع المسمار دليل وغرست في وقت لاحق مع خلايا لم يموتوا أو تعاني من أي مضاعفات عصبية نتيجة لهذا الإجراء. وقد نجا الحيوانات الماضي 100 يوما من دون أي مضاعفات. وعلى الرغم من أننا يفضل استخدام ماوس أصلع ، ماوس المناعية للخطر مع الشعر مثل SCID تكون مجرد مناسبة شريطة أن إزالة الشعر الجمجمة قبل الجراحة للحفاظ على موقع نظيفة ومنع التداخل مع الشعر المسمار الدليل.
هناك العديد من العلاجات الجديدة التي يجري تطويرها حاليا لعلاج دبقي 8-10. وأظهرت مؤخرا أننا يمكن تحت الجلد U87MG xenografts دبقي تثبطها المعاملة مع AMG102 3 ؛ الأجسام المضادة الموجهة إلى أنسنة HGF يخضع حاليا لتقييم سريري في دبقي 5. استخدمنا أسلوب تصف هنا لإنشاء الأورام داخل الجمجمة U87MG في أدمغة الفئران عارية. دراستنا تبين بوضوح مدى فائدة الطريقة ويوضح أن كثيرا من AMG102 يثبط نمو xenografts U87MG مثلي. وسوف نواصل استخدام هذا النموذج لتحديد ما يمكن أن تستخدم العلاجات الأخرى في تركيبة مع AMG102 الحصول على تثبيط أكثر فعالية لنمو الورم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر Verlene هنري وهولمز ليندساي للمساعدة في تطوير هذا النموذج. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة جيمس س. ماكدونيل (# 220020173).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
- Lal, S. An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals. J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).
- Jun, H. T. AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts. Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).
- Pillay, V. The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases. Neoplasia. 11, 448-458 (2009).
- Buchanan, I. M. Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102. J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).
- Wen, P. Y. A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma. Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).
- Caretti, V. Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model. Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).
- Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization. Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).
- Johns, T. G. The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization. Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).
- Scott, A. M. A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).
- Niyazi, M. Therapeutic options for recurrent malignant glioma. Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).
