一个简单的指南螺杆颅内移植瘤小鼠的研究方法

1。细胞系在大型组织，辅以5％胎牛血清（FBS），DMEM – F12文化烧瓶的U87MG胶质瘤细胞培养。 细胞是由磷酸用温水冲洗烧瓶两次收获缓冲液（PBS）和孵化，在37 ° C时5分钟10毫升的PBS，含0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA。一旦细胞被取消，他们是文化传媒和离心（4分钟）300 X克含10毫升到50毫升的管。 洗净后，细胞悬浮在浓度为10 × 10 6 /毫升培养基，允许50,000个细胞/ 5μL接种。 细胞被保存在冰直到颅内注射。 2。丝杠颅内抽薹 此过程可进行数天前的细胞注射。这里描述的所有程序已经进行了严格的无菌条件下。 编号小鼠（BALB / C NU / NU女性; 5-6周;约18克）是用于识别目的，称重并与腹腔注射氯胺酮（100毫克/公斤）和甲苯噻嗪（5毫克的混合物（IP）的anesthetised /公斤）。 碘溶液擦拭皮肤，沿中线和前双耳线右侧小切口（2-3毫米）。这暴露颅骨冠状面和矢状面的缝合。前囟门是定位在这两个缝线交界处。 丝杠的切入点，然后标记在一个点上侧2.5毫米和1毫米前的前囟。这点是位于正上方的尾状核1。 1 × 1毫米的深孔钻举行麻花钻硬脑膜通过头骨无菌手。 成孔，用螺丝刀将延长到硬脑膜的头骨表面以下 1.6毫米的消毒丝杠然后狂奔，直到冲洗的头骨（图1A ）。 无菌钢丝或螺丝假人，然后放置到丝杠的中心孔关闭开幕（图1B）。 Vetbond组织粘合剂（N -氰基丙烯酸正丁酯）和小鼠封闭伤口reversine腹腔注射液（小动物）（0.1毫升/公斤）和卡洛芬镇痛（5 mg/kg/100μL）。小鼠变暖垫（36℃），这可能需要长达20分钟，然后让其恢复。老鼠经常在此期间恢复时间的监测和观察，直至他们完全清醒。 3。颅内细胞植入无菌铐汉密尔顿注射器准备用一个小塑料环，只允许2毫米的针头，针头，延长丝杠插座（图1B）以下。最后的接种点，因此颅骨表面下3.5毫米。 丝杠手术后四天，老鼠再次麻醉上述（2.1）和小切口是在丝杠删除的钢丝。 5μL以及采取预防措施，不能创造或制定任何气泡混合细胞充满铐汉密尔顿注射器。 固定灌注泵注射器和针头插入到丝杠（图1C）。细胞，然后注入每小时30μL的速度。 自动化设备（图1D）允许我们在一个恒定的流量的时候，注入10只动物。细胞也可手动注射，所使用的手铐汉密尔顿注射器或注射器可以由200μL枪头已3毫米修剪，使针尖延长2毫米，超出丝杠铐。注入，然后必须在一个恒定的稳健的步伐。 当输液完成后，小心取下注射器和钢丝更换成丝杠。封闭伤口粘和小鼠前（2.7）恢复的药物，并允许恢复变暖垫。 4。治疗的挑战 4天的U87MG细胞接种后，小鼠称重，随机分为对照组和治疗组。 对照组给予PBS（100μL）腹腔（IP）的注射，而治疗组给予AMG102（100微克，在100μL的PBS）的IP注射。 重复注射每隔一天为14天，共6注射（图2）。 最后的注射后，老鼠每天监测和权衡每隔一天。 当小鼠开始显示显著的神经功能障碍（平衡紊乱，瘫痪），脱水，或超过10％的重量损失或垂死的，他们被人道人道毁灭。这些人性化的终点天，然后记录Kaplan – Meier生存曲线。 5。治疗效率的评价</p> Kaplan – Meier生存曲线生成使用GraphPad棱镜4.03为Windows; GraphPad软件，圣地亚哥美国加利福尼亚州， www.graphpad.com 3。死亡或euthanizations标记为终点事件，得分为1。在实验结束后还活着的动物仍然被作为非活动记录，得分为0。 6。代表性的成果： 控制动物开始后显示的初始接种细胞，神经系统紊乱和减肥23天的迹象。这是在35天的AMG102组显着延迟。事实上，35天，77％（N = 7 / 9），对照组已安乐死。 Kaplan – Meier生存曲线清楚地表明AMG102治疗（图3）的存活率显着增加。 70天，对照组小鼠的88％已被实施安乐死（N = 8 / 9）相比，37％（N = 3 / 8）AMG102治疗组。大脑的组织学分析证实，在对照组的全部9个动物开发的肿瘤相比，只有8 AMG102治疗的小鼠（图4）3。 图1：图像（a）显示在上方位于尾状核的区域定位颅内丝杠。铐汉密尔顿注射器（与细胞预装），然后放置内丝杠2毫米的针头，使超出指导和尾状核细胞内注入3.5毫米。注射器后取出，取而代之的是一个钢丝（二）。自动输液器（C）可以注入10只动物在同一时间。这里展示的是五（四）同时注射。 图2：原理的研究协议。 0天细胞注射治疗第4天开始。对照组动物注射PBS（100μL）的IP，而治疗组接受注射的AMG102（100μg/100μL）IP。这些注射，每隔一天为10天。一共有6次注射。动物被监测的70天的神经系统和物理扰动的迹象。 图3：Kaplan – Meier生存曲线比较控制和治疗的小鼠AMG102。 AMG102（P = 0.005），治疗后获得显著的生存。 图4：显微冠状脑肿瘤的发展，在控制动物（一）在AMG102治疗的动物和无脑肿瘤的发展（二）部分展示。比例尺为1毫米。