Una guía sencilla Método de tornillo para intracraneal Estudios xenoinjerto en ratones

1. Las líneas celulares U87MG células de glioma se cultivan en grandes frascos de cultivo de tejidos con DMEM-F12 suplementado con suero fetal bovino al 5% (FBS). Las células se recogen por lavado de botellas en dos ocasiones con fosfato caliente (PBS) y la incubación a 37 ° C durante 5 minutos con 10 ml de PBS que contiene 0,25% de tripsina y EDTA al 0,05%. Una vez que las células se levantan, se colocan en un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medios de cultivo y se centrifuga (300 X g durante 4 minutos). Tras el lavado, las células se resuspenden a una concentración de 10 x 10 6 / ml en medios de cultivo, lo que permitió la inoculación de 50.000 células / l 5. Las células se mantienen en hielo hasta que la inyección intracraneal. 2. Guía intracraneal tornillo atornillado Este procedimiento puede ser llevado a cabo varios días antes de la inyección de las células. Todos los procedimientos descritos aquí se han llevado a cabo bajo estrictas condiciones de esterilidad. Ratones (BALB / c nu / nu hembra; 5-6 semanas, aproximadamente 18 g) se numeran para su identificación, peso y anestesiados con una intraperitoneal (IP) la inyección de una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg). La piel es limpiar con una solución de yodo y de una pequeña incisión (2-3 mm) se realiza a lo largo de la parte derecha de la línea media y anterior a la línea interaural. Esto expone a las suturas coronal y sagital del cráneo. El bregma se coloca en la unión de estos dos puntos de sutura. El tornillo de guía de punto de entrada se marca en un punto de 2,5 mm lateral y 1 mm anterior al bregma. Este punto está situado directamente sobre el núcleo caudado 1. Un agujero de 1 x 1 mm de profundidad se perfora con una mano estéril cabo fresa espiral a través del cráneo a la duramadre. Un tornillo de guía esterilizada que se extiende 1,6 mm por debajo de la superficie del cráneo en la duramadre se atornilla en el agujero con un destornillador hasta que quede nivelado con el cráneo (Figura 1). Un estilete estéril o ficticia tornillo se coloca en el orificio central de la guía de tornillo para cerrar la abertura (fig. 1B). La herida se cierra con adhesivo tisular Vetbond (cianoacrilato de n-butilo) y los ratones se les da una inyección intraperitoneal de reversine (animales pequeños) (0,1 ml / kg) y carprofeno (5 mg/kg/100 l) para la analgesia. Los ratones se dejan de recuperar en una estera de calentamiento (36 ° C), que puede tardar hasta 20 minutos. Los ratones son frecuentemente monitoreados y observados durante este tiempo de recuperación hasta que estén plenamente conscientes. 3. El injerto celular intracraneal Una jeringa con manguito Hamilton se prepara mediante la aplicación de un anillo de plástico a la punta de la aguja que permite sólo 2 mm de la aguja para extenderse por debajo de la salida del tornillo de guía (fig. 1B). El punto final es por lo tanto, la inoculación de 3,5 mm por debajo de la superficie del cráneo. Cuatro días después de la cirugía tornillo guía, los ratones son anestesiados de nuevo que el anterior (2,1) y una pequeña incisión sobre el tornillo de trabajo para retirar el estilete. El manguito jeringa Hamilton se llena con 5 l de las células y en común, teniendo precaución de no crear o elaborar cualquier burbuja de aire. La jeringa se sujeta a la bomba de perfusión y la aguja se inserta en el tornillo de guía (fig. 1C). Las células se infunden a una velocidad de 30 l por hora. El aparato automatizado (Figura 1 D) nos ha permitido inyectar un máximo de 10 animales a la vez, con un caudal constante. Las células también se puede inyectar de forma manual mediante el uso de la jeringa Hamilton esposadas o, alternativamente, la jeringa puede ser esposado por una punta de la pipeta 200 l que se ha reducido en 3 mm para permitir que la punta de la aguja para extender más allá de la guía de tornillo de 2 mm. La inyección se debe realizar a un ritmo constante constante. Cuando se haya completado la infusión, la jeringa se retira cuidadosamente el estilete y se sustituye en el tornillo de guía. La herida está cerrada y pegada a los ratones se les da medicamentos recuperación como antes (2,7) y les permite recuperar en una estera de calentamiento. 4. Desafío terapéutico Cuatro días después de la inoculación de células U87MG, los ratones se pesan y se dividieron aleatoriamente en los grupos control y tratamiento. El grupo control se le da una intraperitoneal (IP) de inyección de PBS (100 l), mientras que el grupo de tratamiento es una inyección IP de AMG102 (100 mg en 100 l de PBS). Las inyecciones se repiten cada dos días durante 14 días, un total de 6 inyecciones (Figura 2). Después de la última inyección, los ratones son monitoreados diariamente y se pesaron cada dos días. Cuando los ratones comenzaron a mostrar importantes disfunciones neurológicas (balance de perturbación, parálisis), deshidratación, o más del 10% de pérdida de peso o moribundos, que fueron sacrificados humanitariamente. Estos humano de punto final de día se registraron luego de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier. 5. Evaluación de la eficacia terapéutica </p> La curva de supervivencia Kaplan-Meier se ha generado utilizando GraphPad Prism 4.03 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU., www.graphpad.com 3. Muertes o euthanizations se han marcado como eventos de punto final y anotó el 1. Los animales que se mantuvo con vida al final del experimento se registraron como no-acontecimientos y anotó como 0. 6. Los resultados representativos: Control de los animales comenzaron a mostrar signos de trastornos neurológicos y pérdida de peso 23 días después de la inoculación inicial de las células. Esta se retrasó significativamente en el grupo tratado AMG102 a 35 días. De hecho el día 35, el 77% (n = 7 / 9) del grupo de control habían sido sacrificados. La curva de supervivencia Kaplan-Meier muestra claramente el aumento significativo de la supervivencia en respuesta a AMG102 tratamiento (Figura 3). Al día 70, el 88% de los ratones de control había sido sacrificado (n = 8 / 9) en comparación con el 37% (n = 3 / 8) de AMG102 grupo tratado. El análisis histológico de los cerebros confirmó que todos los 9 animales del grupo control desarrollaron tumores en comparación con sólo 3 de los 8 AMG102 ratones tratados (Figura 4). Figura 1: Imagen (A) muestra el tornillo guía intracraneal colocado en un área situada directamente sobre el núcleo caudado. El manguito jeringa Hamilton (pre-cargado con células) se coloca en el interior del tornillo de guía para que 2 mm de la aguja se extiende más allá de la guía y las células se inyectan 3,5 mm en el interior del núcleo caudado. La jeringa más tarde se extrae y se reemplaza por un mandril (B). El dispositivo de infusión automática (C) puede inyectar hasta 10 animales a la vez. Aquí se muestran cinco inyecciones simultáneas (D). Figura 2: Esquema del protocolo del estudio. Las células fueron inyectadas en el día 0 con el tratamiento a partir del día 4. Los animales control recibieron una inyección de PBS (100 l) IP, mientras que el grupo de tratamiento recibió una inyección de AMG102 (100 mg/100 l) IP. Estas inyecciones se administraron en días alternos durante 10 días. Un total de 6 inyecciones se administraron. Los animales fueron controlados después de 70 días para detectar signos de trastornos neurológicos y físicos. Figura 3: curvas de Kaplan-Meier comparando el control y AMG102 los ratones tratados. Significativa en la supervivencia se obtuvo tras el tratamiento con AMG102 (p = 0,005). Figura 4: Microfotografías de las secciones del cerebro coronal que demuestra el desarrollo de tumores en los animales control (A) y no el desarrollo de tumores cerebrales en los animales tratados AMG102 (B). Barra de escala es de 1 mm.