מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

1. שורות תאים U87MG glioma הם תאים בתרבית רקמה גדול תרבות צלוחיות עם DMEM-F12 בתוספת 5% נסיוב עוברי שור (FBS). תאים נקצרים על ידי שטיפה צלוחיות פעמיים עם בופר פוספט חם (PBS) וכן דוגרים אותם 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם 10 מ"ל של PBS המכילה טריפסין 0.25% ו 0.05% EDTA. לאחר התאים הרים, הם ממוקמים לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של התקשורת בתרבות centrifuged (300 גרם X דקות 4). בעקבות לשטוף, תאים resuspended בריכוז של 10 x 10 6 / ml בתקשורת תרבות, שאיפשר הרכבה של 50,000 תאים / 5 μl. תאים הם שמרו על הקרח עד הזרקה תוך גולגולתי. 2. מדריך בורג נעילה תוך גולגולתי הליך זה יכול להתבצע מספר ימים לפני הזרקה של תאים. הנהלים כל המתואר כאן בוצעו בתנאים סטריליים קפדניים. עכברים (BALB / c נו / נו נקבה, 5-6 שבועות, כ 18g) ממוספרים למטרות זיהוי, שקלו anesthetised עם זריקה (IP) intraperitoneal מתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5 מ"ג / ק"ג). העור הוא ניגב את פתרון יוד חתך קטן (2-3 מ"מ) נעשית בצד הימני של קו האמצע ו קדמית לקו interaural. זה חושף את התפרים העטרה ועל sagittal הגולגולת. גבחת ממוקמת בצומת של שני התפרים. בורג המדריך נקודת כניסה ואז מסומן בנקודה 2.5 מ"מ לרוחב ו – 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת. נקודה זו ממוקמת ישירות מעל גרעין caudate 1. 1 x 1 מ"מ חור עמוק הוא קדח ביד סטרילי נערך תרגיל טוויסט דרך הגולגולת אל דורא. בורג מדריך מעוקרים כי ירחיבו 1.6 מ"מ מתחת לפני השטח גולגולות לתוך הדורה הוא מוברג אז עם נהג בורג לתוך החור עד מיושר עם הגולגולת (איור 1A). Stylet סטרילי או דמה הבורג ממוקם מכן לתוך חור הבורג המרכזי של המדריך כדי לסגור את הפתח (איור 1B). הפצע נסגר עם דבק רקמות Vetbond (n-בוטיל cyanoacrylate) ואת העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של reversine (חיות קטנות) (0.1 מ"ל / ק"ג) ו carprofen (5 mg/kg/100 μl) על כאבים. עכברים מותר אז כדי להתאושש על מחצלת התחממות (36 ° C), אשר עשוי להימשך עד 20 דקות. עכברים מנוטרים בתדירות גבוהה נצפתה בתקופה זו התאוששות עד שהם בהכרה מלאה. 3. Engraftment הסלולר תוך גולגולתי מזרק סטרילי אזוקות המילטון מוכן ידי החלת טבעת פלסטיק קטנה עד קצה המחט ומאפשר רק 2 מ"מ של המחט להאריך מתחת לשקע את הבורג מדריך (איור 1B). נקודת הרכבה הסופי ולכן הוא 3.5 מ"מ מתחת לפני השטח את הגולגולת. ארבעה ימים לאחר הניתוח את הבורג מדריך, עכברים הם שוב הרדים לעיל (2.1) ו חתך קטן הוא עשה מעל הבורג מדריך להסרת stylet. מזרק אזוקות המילטון הוא מלא אז עם 5 μl של תאים מעורבים גם לקחת אמצעי זהירות כדי לא ליצור או לערוך כל בועות האוויר. מזרק הוא מאובטח המשאבה זלוף ואת המחט מוחדרת לתוך בורג את המדריך (תרשים 1C). התאים הם חדורים אז בשיעור של 30 μl לשעה. המנגנון האוטומטי (איור 1D) אפשרה לנו להזריק עד 10 חיות בכל פעם בקצב זרימה מתמדת. תאים יכולים גם להיות מוזרק באופן ידני באמצעות מזרק אזוקות המילטון או לחילופין המזרק ניתן אזיקים על ידי טיפ 200 פיפטה μl כי כבר גזוז של 3 מ"מ על מנת לאפשר את קצה מחט להרחיב מעבר לדפוק את המדריך של 2 מ"מ. הזריקה חייבת אז להתבצע בקצב קבוע קבוע. כאשר עירוי תושלם, המזרק הוא הוציא בזהירות את stylet מוחלף לתוך בורג את המדריך. הפצע מודבק סגור העכברים ניתנות תרופות התאוששות כמו קודם (2.7) ואיפשר להתאושש על מחצלת ההתחממות. 4. טיפולית אתגר ארבעה ימים לאחר חיסון התא U87MG, עכברים הם שקלו וחילקו באקראי לתוך מלאה קבוצות הטיפול. בקבוצת הביקורת ניתן התוך צפקי (IP) הזרקה של PBS (100 μl), ואילו בקבוצת הטיפול ניתנת זריקה IP של AMG102 (100 מיקרוגרם ב 100 μl של PBS). זריקות חוזרות מדי יום שני במשך 14 ימים, סך של 6 זריקות (איור 2). לאחר הזריקה האחרונה, עכברים מנוטרים יומי שקל כל יום שני. כאשר העכברים החלו להציג משמעותי בתפקוד הנוירולוגי (הפרעה באיזון, שיתוק), התייבשות, או ירידה במשקל של יותר מ 10% או גוסס, הם היו euthanised אנושי. אנושי אלה נקודת הסיום ימים נרשמו אז על עקומת Kaplan-Meier ההישרדות. 5. הערכת יעילות טיפולית </p> עקומת Kaplan-Meier הישרדות נוצר באמצעות GraphPad פריזמה 4.03 עבור Windows, תוכנה GraphPad, סן דייגו קליפורניה, ארה"ב, www.graphpad.com 3. פטירות או euthanizations סומנו כמטרה נקודות אירועים הבקיע כמו 1. בעלי חיים שנותרו בחיים בתום הניסוי נרשמו אירועים שאינם ציונים כמו 0. 6. נציג התוצאות: חיות בקרת החלה להראות סימנים של הפרעה נוירולוגית וירידה במשקל 23 ימים לאחר חיסון ראשוני של תאים. זו התעכבה באופן משמעותי בקבוצה שטופלה AMG102 עד 35 ימים. ואכן ביום 35, 77% (n = 09/07) של קבוצת הביקורת היו מורדמים. עקומת Kaplan-Meier הישרדות מדגים בבירור את הגידול המשמעותי הישרדות התגובה לטיפול AMG102 (איור 3). ביום 70, 88% של עכברים שליטה היו מורדמים (n = 09/08) לעומת 37% (n = 3 / 8) של קבוצת AMG102 טיפול. ניתוח היסטולוגית של המוח אישר כי כל בעלי חיים 9 בקבוצת הביקורת פיתחו גידולים לעומת 3 בלבד של 8 AMG102 העכברים שטופלו (איור 4). איור 1: תמונה (A) מראה בורג מדריך תוך גולגולתי ממוקם באזור ממוקם ישירות מעל גרעין caudate. אזוקות המילטון מזרק (טעון מראש עם תאים) ממוקמת ואז בתוך בורג מדריך כך 2 מ"מ של מחט חורג מדריך לבין התאים מוזרקים 3.5 מ"מ בתוך גרעין caudate. המזרק הוסר מאוחר יותר הוחלף על ידי stylet (B). מכשיר העירוי האוטומטי (ג) ניתן להזריק עד 10 בעלי חיים בכל פעם. המוצג כאן חמש זריקות סימולטני (ד '). איור 2: סכמטי של פרוטוקול המחקר. הוזרקו תאים ביום 0 עם הטיפול החל ביום 4. חיות בקרת קיבלה זריקה של PBS (100 μl) IP ואילו קבוצת הטיפול קיבלה זריקה של AMG102 (100 μg/100 μl) IP. זריקות אלו ניתנו כל היום השני במשך 10 ימים. סך של 6 זריקות ניתנו. בעלי חיים היו במעקב במשך 70 ימים ואז סימנים של הפרעות נוירולוגיות פיזית. איור 3: Kaplan-Meier עקומת ההישרדות השוואה מלאה AMG102 העכברים שטופלו. הישרדות משמעותי הושג לאחר טיפול עם AMG102 (p = 0.005). איור 4: Microphotographs סעיפים המוח העטרה הוכחת התפתחות הגידול של חיות מלאה (א) ולא התפתחות המוח הגידול של בעלי חיים שטופלו AMG102 (B). בר סולם הוא 1 מ"מ.