マウスにおける頭蓋内異種移植研究のための簡単​​なガイドスクリュー方式

1。細胞株 U87MG神経膠腫の細胞は、5％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM – F12を持つ大規模な組織培養フラスコで培養されています。 細胞は温かいリン酸で二回フラスコを洗浄することによって収穫されている生理食塩水（PBS）は、バッファ、37でそれらをインキュベート° 0.25％トリプシンおよび0.05％EDTAを含むPBS 10mlで5分間。一度細胞が解除され、それらは培養培地、遠心分離（4分間300 × g）を10 mlを入れた50 mlチューブに配置されます。 洗浄後、細胞を10 × 10 6 / 50,000細胞/5μlの接種のために許容される培地のmlの濃度で再懸濁する。 細胞は、頭蓋内注射するまで氷上で保存されています。 2。ボルト頭蓋内ガイドのネジ この手順は、細胞の注入の前に数日間行うことができます。ここで説明するすべての手順は、厳格な無菌条件下で行われている。 マウス（BALB / c NU / NU（メス）、5-6週間、約18グラム）は、ケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（5 mgの混合物の腹腔内（IP）の注入で秤量し、anesthetised、識別の目的で番号が付けられています/ kg）を。 皮膚は、ヨウ素液でダウン拭いていると、小さな切開（2-3 mm）が正中線と両耳ラインの前方の右側に沿って行われます。これは、頭蓋骨の冠状および矢状縫合糸を公開します。ブレグマは、これら2つの縫合糸の接合部に位置している。 ガイド用ネジのエントリポイントは、ポイント横2.5ミリメートルとブレグマの前方を1 mmにマークされています。この点は、直接に尾状核1の上方に位置しています。 1 × 1ミリメートルの深穴は、硬膜に頭蓋骨を介してツイストドリルを保持し、滅菌手で掘られている。 硬膜への頭蓋骨の表面の下に1.6ミリメートルを延長する滅菌ガイド用ネジは、ネジをドライバーで穴にボルトで固定されて頭蓋骨（図1A）と同じ高さになるまで。 滅菌スタイレットまたはスクリューのダミーは、開口部（図1B）をクローズするためのガイド用ネジの中心孔に配置されます。 鎮痛のために傷がVetbond組織接着剤で閉じられます（n -ブチルシアノアクリレート）およびマウスreversineの腹腔内注射（小動物）（0.1 ml / kgをを）与えられ、カルプロフェン（5 mg/kg/100μL）。マウスはその後、20分かかることが温暖化防止マット（36℃）で回復させる。彼らは完全に意識されるまでマウスを頻繁にモニターし、この回復時間の間に観察されています。 3。頭蓋内細胞の生着滅菌カフハミルトンシリンジは、ガイド用ネジコンセント（図1B）の下に拡張するために、針のわずか2 mmを可能に針の先端に小さなプラスチック製のリングを適用することによって調製される。最終的な接種のポイントは、したがって、頭蓋骨の表面の下に3.5ミリメートルです。 ガイド用ネジの手術後4日間、マウスは再び（2.1）上記のように麻酔し、小さな切開は、スタイレットを除去するためのガイド用ネジを介して行われます。 カフハミルトンシリンジは、どのような気泡を作成したり、策定しないように予防策を取ってよく混合した細胞を5μlで満たされている。 シリンジは、注入ポンプに固定され、針をガイドねじ（図1C）に挿入されます。次に、細胞を1時間あたり30μlの割合で注入されています。 自動化装置（図1D）は、私たちは一定の流速で一度に10匹まで注入することができました。細胞はまた、カフ付きハミルトンシリンジを使用して手動で注入することができるか、あるいは注射器を針の先端が2mmからガイド用ネジを超えて拡張できるように3 mmでトリミングされている200μlのピペットの先端で手錠することができます。注入は、一定の安定したペースで実行する必要があります。 注入が完了すると、注射器を注意深く除去され、スタイレットは、ガイドのネジに置き換えられます。傷口が閉じて接着され、マウスが（2.7）以前のように回復薬を与えられ、温暖化のマットの上に回復するために許可されています。 4。治療の課題 U87MG細胞接種4日後、マウスを秤量し、無作為にコントロールし、治療群に分けられます。 治療群がAMG102（PBS100μl中100μgの）のIP注射を与えている間に、対照群は、PBS（100μL）の腹腔内（IP）注射が与えられます。 注射は、14日間は毎秒6日目注射（図2）の合計を繰り返している。 最後の注射後、マウスを毎日モニターし、一日おきに秤量する。 マウスでは有意な神経学的機能障害（平衡感覚障害、麻痺）、脱水、または10％以上の体重減少または瀕死を表示するために始めたとき、彼らは人道的に安楽死された。これらの人道的エンドポイントの日数は、Kaplan – Meier生存曲線を記録した。 5。治療効果の評価</p> Kaplan – Meier生存曲線は、Windows用グラフパッドプリズム4.03を使用して生成され、グラフパッドソフトウェア、サンディエゴカリフォルニア、アメリカ、 www.graphpad.com 3。死亡またはeuthanizationsは、エンドポイントのイベントとしてマークされ、1としてスコア化した。実験終了時に生きて残った動物は、非イベントとして記録され、0としてスコア化した。 6。代表的な結果： 対照動物は23日、細胞の初期接種後の神経障害や体重減少の兆しを示し始めた。これは、大幅に35日にAMG102投与群では遅れていた。確かに35日で、対照群の77％（N = 7 / 9）が安楽死されていた。 Kaplan – Meier生存曲線は明らかにAMG102の治療（図3）に対応して生存率の有意な増加を示しています。 70日では、対照マウスの88％は、AMG102投与群の37％（N = 3 / 8）と比較して（N = 8 / 9）安楽死されていた。脳の組織学的分析は、対照群では全9動物発達した腫瘍は唯一の3 8 AMG102投与したマウス（図4）のと比較していることを確認した。 図1：画像は（）を直接尾状核の上にあるエリアに位置して頭蓋内のガイド用ネジを示しています。針の2mmのガイド超えると細胞は尾状核の内部に3.5ミリメートルを注入されるように、カフ付きハミルトンシリンジ（細胞との事前ロ​​ードされたが）その後、ガイド用ネジの内側に配置されます。注射器は、後にスタイレット（B）によって除去し、置き換えられます。自動注入装置（C）は、一度に10匹まで注入することができます。ここに示した5つの同時注射は、（D）です。 図2：治験実施計画書の回路図。細胞は、治療は4日目に開始0日目に注入した。治療群ではAMG102（100μg/100μL）IPの注入を受けた一方、コントロール動物では、PBS（100μL）IPの注射を受けた。これらの注射は10日間一日おきに与えられた。 6注射の合計が指定されました。動物は、神経学的および物理的な障害の兆候がない70日間モニターした。 図3：コントロールとAMG102処置マウスを比較したKaplan – Meier生存曲線。有意な生存率はAMG102（P = 0.005）で処理した後得られた。 図4：腫瘍対照動物の開発（）とAMG102処理された動物（B）のない脳腫瘍の開発を実証する冠状脳切片の顕微鏡写真。スケールバーは1mmである。