Um método simples parafuso Guia para intracraniana Estudos Xenoenxerto em Ratos

1. Linhagens de células U87MG células glioma são cultivadas em frascos grandes de tecido cultura com DMEM-F12 suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS). As células são colhidas por lavagem frascos duas vezes com fosfato quente Buffered Saline (PBS) e incubando-os a 37 ° C por 5 minutos com 10 ml de PBS contendo 0,25% de tripsina e EDTA 0,05%. Uma vez que as células são levantadas, eles são colocados em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de meios de cultura e centrifugadas (300 g X para 4 min). Após a lavagem, as células são ressuspendidas a uma concentração de 10 x 10 6 / ml em meios de cultura, o que permitiu uma inoculação de 50.000 células / 5 mL. As células são mantidas em gelo até injeção intracraniana. 2. Guia parafuso intracraniana bolting Este procedimento pode ser realizado alguns dias antes da injeção das células. Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados sob estritas condições estéreis. Camundongos (BALB / c nu / nu feminino; 5-6 semanas, aproximadamente 18g) são numerados para fins de identificação, pesados ​​e anestesiados com uma injeção intraperitoneal (ip) de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). A pele é varrida para baixo com uma solução de iodo e de uma pequena incisão (2-3 mm) é feita no lado direito da linha média e anterior à linha interaural. Isso expõe as suturas coronal e sagital do crânio. O bregma é posicionado na junção destas duas suturas. O guia de ponto de entrada do parafuso é então marcada a um ponto 2.5 mm lateral e 1 mm anterior ao bregma. Este ponto está localizado diretamente acima do núcleo caudado 1. A 1 x 1 mm de profundidade buraco é perfurado com uma mão estéril realizada broca através do crânio para a dura. Um parafuso guia esterilizado que se estenderá 1,6 milímetros abaixo da superfície crânios na dura é, então, fugiu para o buraco com uma chave de fenda até que esteja alinhado com o crânio (Figura 1A). Um estilete estéril ou dummy parafuso é então colocada no orifício central do parafuso guia para fechar a abertura (Figura 1B). A ferida é fechada com adesivo de tecido Vetbond (n-butil cianoacrilato) e os ratos recebem uma injeção intraperitoneal de reversine (pequenos animais) (0,1 ml / kg) e carprofeno (5 mg/kg/100 mL) para analgesia. Os ratos são, então, permitiu recuperar em uma esteira de aquecimento (36 ° C), que pode levar até 20 minutos. Ratos são freqüentemente monitoradas e observadas durante este tempo de recuperação até que sejam plenamente consciente. 3. Enxerto celular intracraniana A seringa estéril Hamilton algemado é preparado pela aplicação de um pequeno anel de plástico para a ponta da agulha permitindo apenas dois milímetros da agulha para estender abaixo da saída do parafuso guia (Figura 1B). Do ponto de inoculação final é, portanto, 3,5 milímetros abaixo da superfície do crânio. Quatro dias após a cirurgia parafuso guia, os ratos são novamente anestesiados como descrito acima (2.1) e uma pequena incisão é feita sobre o parafuso guia para retirar o estilete. A seringa Hamilton algemado é então preenchido com 5 mL de bem comum, tendo as células precaução para não criar ou elaborar as bolhas de ar. A seringa é fixada à bomba de perfusão ea agulha é inserida no parafuso guia (Figura 1C). As células são então infundido a uma taxa de 30 mL por hora. O aparelho automatizado (Figura 1D) permitiu-nos a injetar até 10 animais de cada vez, a um fluxo constante. As células também podem ser injetados manualmente usando a seringa hamilton algemado ou, alternativamente, a seringa pode ser algemado por uma ponteira 200 mL que foi cortado por 3 mm para permitir que a ponta da agulha se estender além do parafuso guia por 2 mm. A injeção deve ser realizada em um ritmo constante estacionário. Quando a infusão estiver concluída, a seringa é cuidadosamente removido eo estilete é substituído no parafuso guia. A ferida é fechada colada e os ratos são dadas medicamentos de recuperação como antes (2,7) e tempo para se recuperar em uma esteira de aquecimento. 4. Desafio terapêutico Quatro dias após a inoculação de células U87MG, os ratos são pesados ​​e divididos aleatoriamente em grupos controle e tratamento. O grupo controle é dada uma injeção intra-peritoneal (IP) da PBS (100 l), enquanto o grupo de tratamento é dada uma injeção IP de AMG102 (100 mg em 100 ml de PBS). As injeções são repetidas a cada segundo dia por 14 dias, um total de 6 injeções (Figura 2). Após a última injeção, os ratos são monitoradas diariamente e pesados ​​a cada segundo dia. Quando os ratos começaram a mostrar significativas disfunções neurológicas (saldo perturbação, paralisia), desidratação, ou perda de peso mais de 10% ou moribundo, eles foram abatidos de forma humana. Estes humano ponto final dia foram, então, registada na curva de sobrevida de Kaplan-Meier. 5. Avaliação de eficácia terapêutica </p> A curva de sobrevida de Kaplan-Meier foi gerada usando GraphPad Prism 4,03 para Windows; GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com 3. Mortes ou euthanizations foram marcados como ponto final de eventos e classificada como 1. Animais que permaneceram vivos até o final do experimento foram registradas como não-acontecimentos e pontuada como 0. 6. Resultados representativos: Animais de controle começou a mostrar sinais de perturbação neurológica e perda de peso 23 dias após a inoculação inicial de células. Este foi um atraso significativo no grupo tratado AMG102 a 35 dias. Na verdade o dia 35, 77% (n = 09/07) do grupo controle foram sacrificados. A curva de sobrevida de Kaplan-Meier demonstra claramente o aumento significativo da sobrevida em resposta a AMG102 tratamento (Figura 3). Por 70 dias, 88% dos ratos controle foram sacrificados (n = 09/08) em comparação com 37% (n = 08/03) de AMG102 grupo tratado. A análise histológica do cérebro confirmou que todos os nove animais do grupo controle desenvolveram tumores em comparação com apenas 3 dos 8 AMG102 ratos tratados (Figura 4). Figura 1: Imagem (A) mostra parafuso guia intracraniana posicionados em uma área localizada diretamente acima do núcleo caudado. O algemado hamilton seringa (pré-carregado com células) é então colocado dentro do parafuso guia de forma que 2 mm de agulha se estende além do guia e as células são injetadas 3,5 milímetros no interior do núcleo caudado. A seringa é posteriormente removido e substituído por um estilete (B). O dispositivo automático de infusão (C) pode injetar até 10 animais de cada vez. Aqui mostrados são cinco injeções simultâneas (D). Figura 2: Esquema de protocolo do estudo. Células foram injetadas no dia 0 com o tratamento começa no dia 4. Animais controle receberam uma injeção de PBS (100 l) IP enquanto o grupo de tratamento recebeu uma injeção de AMG102 (100 μg/100 mL) IP. Estas injecções foram dadas a cada segundo dia por 10 dias. Um total de 6 injeções foram dadas. Animais foram monitorados por 70 dias para sinais de distúrbios neurológicos e físicos. Figura 3: Kaplan-Meier comparando a sobrevivência e controle de AMG102 camundongos tratados. Significante de sobrevivência foi obtida após o tratamento com AMG102 (p = 0,005). Figura 4: Microfotografias de seções cérebro coronal demonstrando o desenvolvimento de tumores nos animais controle (A) e não o desenvolvimento do cérebro tumor no AMG102 animais tratados (B). Barra de escala é de 1 mm.