Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

Las células de descongelación Obtener los fibroblastos congelados embriones de ratón (MEFs) (generado previamente del cultivo de embriones primarios individuales) a partir de nitrógeno líquido. Descongelar las células mediante la inmersión en el vial a 37 ° C con agitación hasta que se hayan descongelado por completo. Añadir 9 ml de DMEM que se ha complementado con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina a una placa de cultivo celular de 10 cm. Añadir la suspensión de células descongeladas, gota a gota a la placa, el rock suavemente la placa para dispersar las células de la placa y refrigerarla en un 37 ° C CO, 5% 2 incubadora durante la noche. Tenga en cuenta que si las células son sensibles a DMSO (del proceso de congelación), los medios de comunicación inicial puede ser sustituido por medio fresco después que las células se han adherido a la placa (aproximadamente cuatro horas después de la chapa). También tenga en cuenta que la confluencia de las células después de la descongelación dependerá del número de células congeladas, la tasa de recuperación de las células después de la congelación, y la tasa de crecimiento de las células. Las células de los pases Cuando las células han llegado a prácticamente el 100% de confluencia (por ejemplo: al día siguiente), aspirado de los medios de comunicación y lavar las células con 5 ml de PBS estéril. Quitar PBS y añadir 1 ml de tripsina que contiene 10 mM EDTA y la placa de lugar en la incubadora durante unos 5 minutos para permitir que las células se desprenden de la placa. Cuando las células se han desprendido, agregar 9 ml de los medios de comunicación a las células con tripsina, pipeta de 3.2 veces para dispersar a grupos, añadir 1 ml de esta suspensión, gota a gota en un plato nuevo que contiene 9 ml de los medios de comunicación, y este lugar en los 37 ° C incubadora durante la noche . La presencia de FBS en los medios de inactivar la tripsina, alternativamente, las células se pueden lavar primero a diluir la tripsina. Conteo de células y placas en la cubierta se desliza Eliminar las células de la incubadora, lavar y trypsinize como antes, excepto que esta vez añadir 5-6 ml medios de comunicación de nuevo a las células con tripsina en lugar de 9 ml. Las células con una pipeta a fondo para asegurar la disociación completa en una única suspensión de células, y extraer 15μL para combinar con 15μL de azul tripán en un tubo de microcentrífuga separados. Mezclar esta suspensión celular / azul tripán pipeteando arriba y abajo varias veces, y añadir 15μL del hemocitómetro. Bajo el microscopio, las células muertas que aparecen en azul. Cuente el número de células claras / incoloro (que viven) en una de las redes de 4X4 en el hemocitómetro. Repita este cuenta con las otras tres redes de 4X4 (denominado A, B, C y D) y el uso de la siguiente ecuación para calcular el número de células por microlitro de la suspensión: A través de la optimización del protocolo, hemos determinado que el recubrimiento 30.000 resultados células de la densidad celular apropiada para la visualización a la conclusión del experimento. Para calcular el volumen de suspensión celular necesario para 30.000 celdas, utilice la siguiente ecuación: A continuación, coloque una hoja de cubierta de vidrio estéril en cada pocillo de una placa de seis bien y añadir 2 ml de los medios de comunicación a cada pocillo, y luego añadir, gota a gota de la suspensión de su celular el volumen requerido por 30.000 células en cada pocillo. Tenga en cuenta que se desliza cubierta de vidrio se utilizan para este experimento que vamos a visualizar las células mediante microscopía de fluorescencia en un momento posterior, no todas las aplicaciones necesariamente requerirá de la microscopía, y por lo tanto la cubierta se desliza puede no ser necesaria. Virus de transducción Después de varias horas o (tiempo suficiente para asegurar que las células se adhieren a la cubierta se desliza) durante la noche, retire el material y lavar las células con 1 ml de suero libre de DMEM. Añadir 1 ml de medio libre de suero a cada pocillo de la adición de los virus. Para este experimento, adeno-Cre virus se obtuvo comercialmente de Biolabs Vector. Optimización de protocolos anteriores han demostrado que una multiplicidad de infección (MOI), de 500 proporciona transducción de genes de alta eficiencia en la atención primaria MEFs con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular. MOI se puede calcular de la siguiente manera: Agregar el volumen calculado de virus directamente a cada uno, así que va a ser infectados, agite suavemente la placa para dispersar a los virus de las células y el lugar en la incubadora a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, eliminar el virus que contienen los medios de comunicación de las células y lavar las células en 1 ml de PBS estéril y luego agregar 2 ml de los medios de comunicación regulares para cada pozo. En el caso de las células de Rac1 se ejemplifica en este experimento, se produjeron cambios morfológicos en las células en aproximadamente 72 horas después de transducción. Resultados representante Las células se visualizand mediante la tinción con el colorante phalloidin actina (a efectos de imágenes solamente) y la imagen con el Leica TCS-SP5 multifotónica microscopio láser confocal de barrido en el Centro de Análisis Avanzados de la Universidad de Guelph. La figura 1 muestra la morfología alargada y contratados de la Rac1 flox / flox células que fueron expuestos a virus adeno-Cre en comparación con las mismas células no expuestas al virus. Figura 1. Comparación entre Rac1 flox / flox células infectadas con virus adeno-Cre (izquierda) en comparación con las células no infectadas de la misma fuente (derecha).