Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

Ontdooien cellen Verkrijgen bevroren muis embryonale fibroblasten (MEF) (voorheen gegenereerd uit individuele embryo primaire culturen) van vloeibare stikstof. Dooi cellen door onderdompeling flacon in 37 ° C water met wervelende totdat de inhoud volledig ontdooid. Voeg 9ml van DMEM dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine met een 10cm celcultuur plaat. Voeg de ontdooide celsuspensie druppelsgewijs op de plaat, schud de plaat naar de cellen en laat de plaat te verspreiden in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator 's nachts. Merk op dat als de cellen gevoelig zijn voor DMSO (uit de bevriezing proces), de eerste media kunnen worden vervangen door vers medium nadat cellen hebben gehandeld op grond van de plaat (ongeveer vier uur na de plating). Ook dat samenvloeiing van de cellen opmerking na ontdooien hangt af van het aantal van bevroren cellen, de opbrengst van de cellen na het bevriezen, en de groei van de cellen. Passage cellen Wanneer cellen zijn gegroeid in wezen 100% confluentie (dat wil zeggen: de volgende dag), zuigen uit de media en was cellen met 5 ml steriele PBS. Verwijder de PBS en voeg 1 ml trypsine bevat 10 mM EDTA en laat de plaat in de incubator voor ongeveer 5 minuten om cellen te los van de plaat. Wanneer de cellen hebben losgemaakt, voeg 9ml van media om de getrypsiniseerd cellen, pipet 2-3 keer om groepjes uiteen te drijven, 1 ml van deze suspensie voeg druppelsgewijze op een nieuwe plaat met 9ml van de media, en deze plaats in het 37 ° C incubator 's nachts . De aanwezigheid van FBS in de media zal de trypsine alternatief te inactiveren, kunnen cellen eerst gewassen te verdunnen het trypsine. Tellen en beplating cellen op dekglaasjes Verwijder de cellen van incubator, wassen en trypsinize als voorheen, behalve dat dit keer weer toevoegen 5-6 ml media om de getrypsiniseerd cellen in plaats van 9ml. Pipet cellen grondig in te vullen dissociatie zorgen in een enkele celsuspensie en verwijder 15μL met 15μL van trypan blauw te combineren in een aparte microfugebuis. Mix deze cel / trypan blauw schorsing door en neer te pipetteren meerdere malen, en voeg 15μL aan de hemocytometer. Onder de microscoop, wordt dode cellen verschijnen blauw. Tel het aantal duidelijke / kleurloze (levende) cellen in een van de 4X4 roosters op de hemocytometer. Herhaal deze rekenen op de drie andere 4×4 grids (aangeduid A, B, C en D) en gebruik de volgende vergelijking om het aantal cellen per microliter van de ophanging te berekenen: Door middel van protocol optimalisatie, hebben wij vastgesteld dat plating 30.000 cellen resultaten in geschikte celdichtheid voor visualisatie aan het einde van het experiment. Voor het berekenen van het volume van de celsuspensie die nodig is voor 30.000 cellen, gebruikt u de volgende vergelijking: Plaats nu een steriele glazen deksel glijden in elk putje van een zes goed gerecht en voeg 2 ml van de media aan elk putje, en dan voeg druppelsgewijze uit uw celsuspensie het volume nodig voor 30.000 cellen in elk putje. Merk op dat glas dekglaasjes worden gebruikt voor dit experiment omdat we zullen het visualiseren van de cellen met behulp van fluorescentie microscopie op een later tijdstip, niet alle toepassingen zullen noodzakelijkerwijs microscopie, en dus dekglaasjes mag niet worden verlangd. Virus Transductie Na een aantal uren of een nacht (voldoende tijd om ervoor te zorgen dat de cellen zich houden aan de dekglaasjes), verwijder de media en wassen cellen met 1 ml van het serum-vrij DMEM. Voeg 1 ml serum-vrije media aan elk goed voor de toevoeging van het virus. Voor dit experiment werd adeno-Cre virus in de handel verkrijgbaar bij Vector Biolabs. Vorige protocol optimalisatie heeft aangetoond dat een multipliciteit van infectie (MOI) van 500 zeer efficiënte transductie-gen geeft in primaire MEFs met weinig of geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen. MOI kan als volgt worden berekend: Direct toe te voegen het berekende volume van het virus aan elk goed, dat is besmet zijn, schud de plaat aan het virus en de plaats cellen 's nachts verspreidt zich in de 37 ° C incubator. De volgende ochtend, verwijder de virus-bevattende media uit de cellen en de cellen in 1 ml steriele PBS gewassen en voeg 2 ml van de reguliere media aan elk putje. In het geval van de Rac1 cellen toegelicht in dit experiment, morfologische veranderingen opgetreden in de cellen op ongeveer 72 uur na transductie. Representatieve resultaten Cellen werden visualiserend door kleuring met de kleurstof actine phalloidin (voor imaging doeleinden) en beeld gebracht met behulp van de Leica TCS-SP5 multifoton confocale laser scanning microscoop op de Advanced Analysis Centre van de Universiteit van Guelph. Figuur 1 toont de gecontracteerde en langwerpige morfologie van de Rac1 Flox / Flox cellen die waren adeno-Cre virus worden blootgesteld in vergelijking met dezelfde cellen niet worden blootgesteld aan het virus. Figuur 1. Vergelijking tussen Rac1 Flox / Flox cellen die geïnfecteerd zijn met adeno-Cre virus (links) vergeleken met niet-geïnfecteerde cellen uit dezelfde bron (rechts).