培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

融解細胞液体窒素から凍結マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を（個々の胚初代培養から、以前に生成される）を取得。 37バイアルを浸漬し融解のセル内容が完全に融解するまで渦巻く° Cの水。 10cmの細胞培養プレートに10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン – ストレプトマイシンを補充されたDMEMの9mLを追加。 プレートに滴下融解した細胞懸濁液を追加し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩細胞と場所のプレートを分散させるために軽くプレートを揺らし。プレート（約4時間後メッキ）に付着した細胞は、DMSO（凍結プロセスから）に敏感な場合、初期メディアが、細胞の後に新鮮な培地と交換できることに注意してください。また、凍結した細胞の数は、凍結後の細胞の回収率、および細胞の増殖速度に依存して解凍後の細胞のその合流点に注意してください。 継代細胞細胞がコンフルエントに本質的に100％（例：次の日）に成長しているときに、メディアをオフに吸引し、滅菌PBS 5mlの細胞を洗浄する。 PBSを削除し、細胞がプレートからデタッチするまで、約5分間インキュベーターに10mMのEDTAと場所のプレートを含むトリプシン液1mLを加える。 細胞がはがれるしたら、、塊を分散メディアの9mLを含む新しいプレート上に滴下この懸濁液1mLを追加し、37℃インキュベーターで一晩にこれを置くためにトリプシン処理細胞にメディアの9mLを加え、ピペット2-3回。メディアのFBSの存在が交互にトリプシンを不活性化する、細胞をトリプシンを希釈する最初の洗浄することができます。 カバースリップ上に細胞をカウントし、めっきインキュベーターから細胞を除去する、この時間を除いてバックの代わりに9mLのトリプシン処理細胞に5 – 6mLメディアを追加し、以前と同様に洗浄し、トリプシン処理。 ピペットは、細胞の単一細胞の懸濁液中に完全な解離を確実に、そして別のマイクロチューブにトリパンブルーの15μLと組み合わせること15μL削除する。 数回上下にピペッティングして、このセル/トリパンブルーサスペンションを混合し、血球計算盤に15μL加える。 顕微鏡下で、死細胞は青色表示されます。血球計算板で4X4のグリッドのいずれかで、明確な/無色（生きた）細胞の数を数えます。他の3つの4X4のグリッド（A、B、CとDと表される）で、​​このカウントを繰り返して、サスペンションのμLあたりのセル数を求めるには、以下の計算式を使用します。 プロトコルの最適化を通じ、我々は、実験の終了時に可視化のために適切な細胞密度に30,000細胞の結果をメッキすることを決定した。 30,000細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算するには、次の式を使用します。 現在6つのウェルディッシュの各ウェルに滅菌ガラスカバースリップを配置し、各ウェルにメディアの2mLのを追加して、細胞懸濁液30,000細胞に必要な量から各ウェルに滴下追加。我々は、後の時点で蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化されるようにガラスのカバースリップがこの実験のために使用されることに注意してくださいではないすべてのアプリケーションは、必ずしも顕微鏡を必要とし、したがって、伝票が必要とされていない可能性がありますカバーします。 ウイルスの形質導入数時間または一晩（細胞はカバースリップに従っていることを保証するために十分な時間）の後、メディアを取り出し、無血清DMEM 1mLの細胞を洗浄する。 ウイルスの追加のために各ウェルに無血清培地1mLのを追加。この実験では、アデノウイルスのCreはベクトルBiolabs社から商業的に入手した。 以前のプロトコルの最適化は、500の感染多重度が（MOI）細胞の生存にほとんど、あるいはまったく効果が主のMEFに非常に効率的な遺伝子導入を提供することが示されている。 MOIは次のように計算することができます。 感染している各ウェルに直接ウイルスの計算量を追加して、ゆっくりと一晩37℃のインキュベーター中にウイルスや場所の細胞を分散させるためにプレートを揺らし。 翌朝は、ウイルスを含む細胞から培地を除去し、1mLの滅菌PBSで細胞を洗浄し、各ウェルに定期的なメディアの2mLの追加。 この実験において例示Rac1の細胞の場合には、形態学的変化は、約72時間後に伝達における細胞内で発生した。 代表的な結果視覚化された細胞アクチン染料ファロイジン（イメージングのためだけに）で染色し、ゲルフ大学の高度な分析センターでライカTCS – SP5多光子共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像によるd。図1は、ウイルスにさらされていない同じ細胞と比較して、アデノのCreのウイルスにさらされたRac1のFLOX / FLOX細胞の収縮と伸長形態を示しています。 図1と同じソース（右）から非感染細胞と比較してアデノウイルスのCre（左）に感染してRac1のFLOX / FLOXセル間の比較。