Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

הפשרת התאים השג fibroblasts עכבר קפוא עובריים (MEFs) (שנוצר בעבר מתרבויות העובר הפרט העיקרי) של חנקן נוזלי. תאים הפשירי ידי טבילה בקבוקון מים ב 37 ° C עד מתערבל עם תוכן הם מופשר לחלוטין. הוסף 9mL של DMEM כי כבר השלימו עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תא 10 ס"מ תרבות. מוסיפים את ההשעיה תא מופשר ירידה מבחינת הצלחת, סלע את הצלחת בעדינות לפיזור תאים צלחת מקום 37 ° C CO, 5% 2 החממה לילה. שים לב שאם תאים רגישים DMSO (מתהליך קריותרפיה), אמצעי התקשורת הראשוני יכול להיות מוחלף עם התקשורת לאחר טרי התאים דבק הצלחת (כארבע שעות ציפוי לתגובה). כמו כן שים לב כי מפגש של התאים לאחר ההפשרה תלויה במספר תאים קפואים, קצב התאוששות של תאים לאחר הקפאה, ושיעור הצמיחה של התאים. Passaging תאים כאשר התאים גדלו למעשה 100% confluency (כלומר: למחרת), לשאוב את התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ"ל של PBS סטרילית. הסר PBS ולהוסיף 1mL של טריפסין המכיל 10mm EDTA צלחת מקום בחממה במשך כ 5 דקות, כדי לאפשר לתאים לנתק מהצלחת. כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 9mL התקשורת לתאי trypsinized, פיפטה 2-3 פעמים כדי לפזר גושים, מוסיפים 1mL של השעיה זו ירידה מבחינת לצלחת חדש המכיל 9mL של התקשורת, במקום הזה לתוך 37 ° C חממה לילה . הנוכחות של FBS בתקשורת יהיה להשבית טריפסין לחילופין, תאים ניתן לכבס הראשון לדלל את טריפסין. ספירת תאים ו ציפוי על גבי תלושי לכסות הסרת תאים חממה, לרחוץ trypsinize כמו קודם, אלא שהפעם להוסיף 5-6mL התקשורת חזרה את התאים trypsinized במקום 9mL. תאים פיפטה ביסודיות כדי להבטיח ניתוק מוחלט לתוך ההשעיה תא בודד, ולהסיר 15μL לשלב עם 15μL של trypan כחול בצינור microfuge נפרד. מערבבים את ההשעיה תא / trypan כחול על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להוסיף 15μL hemocytometer. מתחת למיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע כחול. ספירת התאים ברור / צבע (חי) באחד רשתות 4X4 על hemocytometer. חזור על פעולה זו מספר על שלוש רשתות אחרות 4X4 (מצוין, B, C ו-D) ולהשתמש המשוואה הבאה כדי לחשב את מספר התאים לכל μL של השעיה: באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקול, יש לנו קבעו כי ציפוי 30,000 תוצאות תאים צפיפות התאים המתאימים להדמיה בסיומו של הניסוי. כדי לחשב את נפח תא ההשעיה הדרושים 30,000 תאים, השתמש המשוואה הבאה: עכשיו במקום זכוכית סטרילית לכסות להחליק לתוך היטב כל מנה שישה היטב ולהוסיף 2ml של התקשורת זה היטב, ולאחר מכן להוסיף טיפה חכם מן ההשעיה הסלולרי שלך נפח הנדרש 30,000 תאים לתוך כל טוב. שים לב לכסות תלושי כוס משמשים בניסוי זה כפי שאנו יהיה לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב מאוחר יותר, לא כל היישומים דורשים בהכרח מיקרוסקופ, ובכך מכסה מחליק לא ייתכן שתידרש. וירוס התמרה אחרי כמה שעות (או זמן מספיק על מנת להבטיח כי התאים לדבוק תלושי כיסוי) למשך הלילה, להסיר ולשטוף התקשורת תאים עם 1mL של סרום ללא DMEM. הוסף 1mL של סרום ללא מדיה גם עבור כל תוספת של הנגיף. לצורך ניסוי זה, adeno-Cre וירוס הושג מסחרית מן Biolabs וקטור. אופטימיזציה של פרוטוקול קודם הראה כי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 500 מספק התמרה גן היעילה ביותר תוך MEFs ראשוני עם מעט או ללא השפעה על כדאיות התא. משרד הפנים יכול להיות מחושב באופן הבא: מוסיפים את נפח מחושב של הנגיף ישירות היטב כל זה להיות נגוע, רוק בעדינות את הצלחת לפזר את התאים וירוס מקום לתוך 37 ° C חממה לילה. למחרת בבוקר, להסיר את הווירוס המכילים מדיה מן התאים ולשטוף תאים 1mL סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 2ml התקשורת קבוע היטב כל אחד. במקרה של Rac1 תאים שהודגם בניסוי הזה, התרחשו שינויים מורפולוגיים בתאים על כ 72 שעות שלאחר התמרה. נציג תוצאות תאים היו לדמייןד על ידי צביעה עם צבע אקטין phalloidin (למטרות הדמיה בלבד) צילמו באמצעות TCS-Leica SP5 multiphoton מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר במרכז ניתוח מתקדם באוניברסיטת Guelph. איור 1 מציג את המורפולוגיה התכווצה מוארכת של Rac1 flox / flox תאים שנחשפו לנגיף adeno-Cre לעומת התאים אותו לא נחשף לנגיף. באיור 1. השוואה בין תאים Rac1 flox / flox נגוע adeno-Cre וירוס (משמאל) לעומת תאים נגוע מאותו מקור (מימין).