Аденовирус-опосредованной Генетические Удаление сигнальных молекул в культуре первичных мышиных эмбриональных фибробластов

Размораживание клетки Получить замороженных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) (созданный ранее из отдельных эмбриона первичных культур) с жидким азотом. Оттепель клетки путем погружения флакона в 37 ° С воду с закрученной пока содержимое полностью оттаять. Добавить 9mL из DMEM, который был с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина стрептомицин к культуре пластины ячейки 10см. Добавить талой клеточной суспензии по каплям к пластине, рок-пластинка аккуратно, чтобы разогнать клетки и поместить пластинку в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в одночасье. Заметим, что если клетки чувствительны к ДМСО (от замораживания процесса), начальные средства массовой информации может быть заменен на свежий СМИ после того, клетки присоединившимся к пластине (примерно четыре часа после покрытия). Также отметим, что слияние клеток после оттаивания зависит от количества клеток заморожены, скорость восстановления клеток после замораживания, а темп роста клеток. Пассирования клетки Когда клетки росли, чтобы по существу, 100% слияния (то есть: на следующий день), аспирация от средств массовой информации и промыть клетки с 5 мл стерильной PBS. Удалить PBS и добавьте 1 мл трипсина содержащей 10 мМ ЭДТА и место пластину в инкубаторе в течение примерно 5 минут, чтобы дать клеткам отсоединиться от пластины. Когда клетки имеют индивидуальный добавить 9mL средств массовой информации для трипсином клетки, пипетки 2-3 раза, чтобы разогнать скопления, добавьте 1 мл этой суспензии по каплям на новую пластину, содержащую 9mL средств массовой информации, и место это в 37 ° С инкубатор ночь . Наличие FBS в СМИ инактивирует трипсин альтернативно, клетки могут быть вымыты первый разбавить из трипсина. Подсчет и покрытие клеток на покрытие проскальзывает Удалить клетки из инкубатора, вымыть и trypsinize как и раньше, но на этот раз добавить 5-6 мл СМИ назад к трипсином клетки вместо 9mL. Внесите клетки тщательно для обеспечения полной диссоциации в суспензии отдельных клеток, и удалить 15μL сочетать с 15μL трипановой синий в отдельной трубке отцентрифугировать. Смешайте эту ячейку / трипанового синего подвески с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и добавить к 15μL гемоцитометра. Под микроскопом, мертвые клетки появится синий. Подсчитайте количество очистки / бесцветный (живых) клеток в одном из 4X4 сеток на гемоцитометра. Повторите эту рассчитывать на три другие сетки 4X4 (обозначается A, B, C и D) и использовать следующее уравнение для расчета количества клеток в мкл подвеска: Благодаря оптимизации протокола, мы определили, что покрытие 30000 клеток приводит к соответствующей плотности клеток для визуализации в конце эксперимента. Чтобы рассчитать объем клеточной суспензии необходимое для 30000 ячеек используйте следующее уравнение: Теперь место стерильную скольжения покровного стекла в каждую лунку шесть хорошо блюдо и добавить 2 мл среды в каждую лунку, а затем добавить по каплям из вашей клеточной суспензии объем, необходимый для 30000 клеток в каждую лунку. Обратите внимание, что скользит остекления используются для этого эксперимента, как мы будем визуализировать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии на более позднем этапе, не все приложения будут обязательно требует микроскопии, и, таким образом покрытие не скользит могут потребоваться. Вирус трансдукция После нескольких часов или на ночь (достаточно времени для того, чтобы клетки придерживаются крышки слипы), удалить средства массовой информации и мыть клетки с 1 мл бессывороточной DMEM. Добавить 1 мл сыворотки, свободных средств массовой информации в каждую лунку для добавления вируса. Для этого эксперимента, адено-вирус Cre было получено коммерчески Векторные Биолабс. Предыдущая оптимизация протоколов показал, что множественность заражения (МВД) в 500 обеспечивает высокую эффективность генной трансдукции в первичные MEFs практически не влияет на жизнеспособность клеток. МВД может быть рассчитана следующим образом: Добавить расчетный объем вирус непосредственно в каждую лунку, которая должна быть инфицированы, мягко рок пластины, чтобы рассеять вирус и поместить клетки в 37 ° С инкубатор в одночасье. Следующим утром, удалить вирус-содержащих средств массовой информации из клетки и мыть клеток в 1 мл стерильной PBS, а затем добавить 2 мл регулярных средств массовой информации в каждую лунку. В случае Rac1 клетки примером в этом эксперименте, морфологические изменения произошли в клетки примерно в 72 часа после трансдукции. Представитель Результаты Клетки визуализироватьг окрашиванием актина красителя фаллоидином (для работы с изображениями целей) и отображение использовании Leica TCS SP5-многофотонной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на Расширенный Центра анализа в Университете гвельфов. На рисунке 1 показан контракт и удлиненные морфологии Rac1 FLOX / FLOX клетки, которые подвергались адено-вирус Cre сравнению с тем же клетки не подвергаются воздействию вируса. Рисунок 1. Сравнение Rac1 FLOX / FLOX клетки, инфицированные адено-вирус Cre (слева) по сравнению с незараженных клеток из того же источника (справа).