Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

Células descongelamento Obtenção de fibroblastos de rato congelado embrionárias (MEFs) (gerado anteriormente a partir de culturas primárias individuais de embriões) de nitrogênio líquido. Células descongelar por imersão frasco em 37 ° C de água com movimentos circulares até conteúdo esteja completamente descongelado. Adicionar 9ml de DMEM que foi suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a uma placa de cultura de células 10 centímetros. Adicione a suspensão de células descongeladas gota a gota, à placa, rock a placa suavemente para dispersar as células e colocar a placa em 37 ° CO C, 5% 2 incubadora durante a noite. Note-se que se as células são sensíveis à DMSO (a partir do processo de congelamento), meios de comunicação inicial pode ser substituído com a mídia fresco depois que as células tenham aderido à placa (aproximadamente quatro horas após a plating). Observe também que confluência das células após o descongelamento depende do número de células congeladas, a taxa de recuperação das células após o congelamento, ea taxa de crescimento das células. Células Passaging Quando as células têm crescido a confluência essencialmente 100% (ou seja: no dia seguinte), aspirar a mídia off e lavar as células com 5mL de PBS estéril. Remover PBS e adicionar 1 ml de tripsina contendo 10mM EDTA e colocar a placa na incubadora por aproximadamente 5 minutos para permitir que as células de separar da placa. Quando as células têm destacado, adicione 9ml de mídia para as células tripsinizados, pipeta 2-3 vezes para dispersar aglomerações, adicione 1 mL desta suspensão gota a gota, em um prato novo contendo 9ml de mídia, e colocar isso para a 37 ° C durante a noite incubadora . A presença de FBS na mídia vai inativar a tripsina, alternativamente, as células podem ser lavadas primeiro a diluir a tripsina. Contagem e cultivo de células em lamínulas Remover as células da incubadora, lavar e trypsinize como antes, só que desta vez adicionar 5-6ml de volta para o tripsinizados células em vez de 9ml. Células pipeta cuidadosamente para garantir total dissociação em uma suspensão de células individuais, e remover 15μL para combinar com 15μL de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga separado. Misturar esta suspensão celular / azul de tripano pipetando cima e para baixo várias vezes, e adicionar 15μL para o hemocitômetro. Sob o microscópio, as células mortas aparecerá azul. Contar o número de células claras / incolor (vivendo) em uma das grades 4X4 sobre o hemocitômetro. Repita este contar com as três outras grades 4X4 (A denotado, B, C e D) e use a seguinte equação para calcular o número de células por mL de suspensão: Através da otimização de protocolo, nós determinamos que chapeamento de 30.000 células resulta na densidade de células adequadas para visualização na conclusão do experimento. Para calcular o volume de suspensão de células necessárias para 30.000 células, use a seguinte equação: Agora coloque uma lamínula estéril de vidro em cada poço de uma placa de seis bem e adicione 2 ml de mídia para cada poço, e depois adicionar gota a gota, a partir de sua suspensão celular o volume necessário para 30.000 células em cada poço. Note-se que lamínulas de vidro são usados ​​para este experimento, já que estaremos visualizando as células usando microscopia de fluorescência em um ponto mais tarde, nem todos os aplicativos serão necessariamente microscopia, e, assim, cobrir deslizes não podem ser exigidos. Transdução de vírus Depois de várias horas ou durante a noite (tempo suficiente para assegurar que as células aderem à lamínulas), remova a mídia e lavar as células com 1 ml de soro livre de DMEM. Adicione 1 ml de soro livre de media a cada poço para a adição do vírus. Para este experimento, vírus adeno-Cre foi obtido comercialmente a partir de Biolabs Vector. Otimização de protocolo anterior mostrou que uma multiplicidade de infecção (MOI) de 500 fornece transdução de genes altamente eficiente em MEFs primária com pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular. MOI pode ser calculado como segue: Adicionar o volume calculado de vírus diretamente a cada poço que está a ser infectado, agite levemente o prato para dispersar as células de vírus e colocar na incubadora a 37 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, remova o vírus contendo mídia a partir de células e lavar as células em 1mL de PBS estéril e em seguida, adicione 2 mL de meios regulares a cada poço. No caso do Rac1 células exemplificado neste experimento, ocorreram alterações morfológicas nas células em aproximadamente 72 horas de transdução de post. Resultados representante Células foram visualized através da coloração com o corante de actina phalloidin (para fins de imagem apenas) e fotografada usando a Leica TCS-SP5 multifotônica microscópio laser confocal no Centro de Análise Avançada da Universidade de Guelph. A Figura 1 mostra a morfologia contratados e alongado do Rac1 flox / flox células que foram expostos ao vírus adeno-Cre em comparação com as mesmas células não expostas ao vírus. Figura 1. Comparação entre Rac1 flox / flox células infectadas com o vírus adeno-Cre (esquerda) em comparação com células não infectadas pela mesma fonte (direita).