Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Auftauen von Zellen Erhalten eingefroren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) (zuvor aus einzelnen Embryos primären Kulturen generiert) von flüssigem Stickstoff. Thaw Zellen durch Eintauchen Fläschchen in 37 ° C Wasser mit wirbelnden, bis Inhalt vollständig aufgetaut. Add 9 mL DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin zu einer 10cm Zellkulturplatte ergänzt wurde. Fügen Sie die aufgetaute Zellsuspension tropfenweise auf die Platte, Rock die Platte vorsichtig, um Zellen und Platzteller in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator über Nacht zu zerstreuen. Beachten Sie, dass, wenn die Zellen empfindlich auf DMSO (aus dem Einfrieren Prozess) sind erste Medien mit frischen Medien ersetzt werden kann, nachdem die Zellen an der Platte (ca. 4 Stunden post plating) haften geblieben sind. Beachten Sie auch, dass Zusammenfluss der Zellen nach dem Auftauen ist abhängig von der Anzahl der Zellen eingefroren, die Erholung der Zellen nach dem Einfrieren und die Wachstumsrate der Zellen. Passagierung Zellen Wenn die Zellen zu praktisch 100% Konfluenz (dh: am nächsten Tag) gewachsen, absaugen den Medien und waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem PBS. Entfernen PBS und 1ml von Trypsin mit 10 mM EDTA und Platzteller in Inkubator für ungefähr 5 Minuten, damit sich Zellen von der Platte zu lösen. Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen 9 mL der Medien auf die Trypsin-Zellen, Pipette 2-3 mal um Klumpen zu zerstreuen, 1ml dieser Suspension tropfenweise auf eine neue Platte mit 9 mL der Medien, und legen Sie diese in die 37 ° C Inkubator über Nacht . Die Anwesenheit von FBS in den Medien wird das Trypsin alternativ zu inaktivieren, können Zellen zuerst gewaschen werden, um zu verdünnen die Trypsin. Zählen und Beschichtung von Zellen auf Deckgläser Entfernen Zellen aus Inkubator, waschen und trypsinize wie vorher, nur dieses Mal add 5-6mL Medien zurück zu den trypsiniert Zellen anstelle von 9 mL. Pipette Zellen gründlich, um eine vollständige Dissoziation in einer einzigen Zellsuspension zu gewährleisten, und entfernen Sie 15μL mit 15μL von Trypanblau in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. Mix dieser Zelle / Trypanblau Suspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, und fügen Sie 15μL der Zählkammer. Unter dem Mikroskop wird abgestorbenen Zellen erscheinen blau. Zählt die Anzahl der klar / farblos (Wohn-) Zellen in einer der 4X4 Gitter auf der Zählkammer. Wiederholen Sie diesen zählen die drei anderen 4X4 Grids (bezeichnet A, B, C und D) und verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Anzahl der Zellen pro Mikroliter Suspension zu berechnen: Durch Protokoll-Optimierung, haben wir festgestellt, dass plating 30.000 Zellen Ergebnisse in geeigneter Zelldichte für die Visualisierung am Ende des Experiments. Zur Berechnung des Volumens der Zellsuspension für 30.000 Zellen benötigt, verwenden Sie die folgende Gleichung: Legen Sie nun ein steriles Deckglas in jedes Well einer sechs gut Schüssel und fügen 2 ml Medium in jede Vertiefung, und dann tropfenweise aus Ihrer Zellsuspension das Volumen für 30.000 Zellen benötigt in jedes Well. Beachten Sie, dass Glasdeckgläschen für dieses Experiment verwendet werden, wie wir die Visualisierung werden die Zellen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu einem späteren Zeitpunkt, da nicht alle Anwendungen werden notwendigerweise Mikroskopie und decken somit rutscht nicht erforderlich sein. Virus Transduction Nach mehreren Stunden oder über Nacht (genügend Zeit, um sicherzustellen, dass die Zellen auf die Deckgläschen haften), zu entfernen Medien und waschen Sie die Zellen mit 1 ml serumfreiem DMEM. 1ml von serum-freien Medien in jede Vertiefung für die Zugabe des Virus. Für dieses Experiment wurde Adeno-Cre-Virus kommerziell von Vector Biolabs erhalten. Vorherige Protokoll-Optimierung hat gezeigt, dass eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 500 hocheffiziente Gen-Transduktion bietet in primäre MEFs mit wenig oder keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen. MOI kann wie folgt berechnet werden: Fügen Sie das berechnete Volumen der Virus direkt in jede Vertiefung, die infiziert ist, schaukeln die Platte, um das Virus und Ort Zellen in die 37 ° C Inkubator über Nacht zu zerstreuen. Am nächsten Morgen, entfernen Sie den Virus-haltigen Medien aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in 1ml steriles PBS und fügen Sie dann 2 ml regulären Medien in jede Vertiefung. Im Falle der Rac1-Zellen in diesem Experiment veranschaulicht, trat morphologischen Veränderungen in den Zellen bei etwa 72 Stunden nach der Transduktion. Repräsentative Ergebnisse Die Zellen wurden visualisierend durch Färbung mit dem Aktin-Farbstoff Phalloidin (für die Bildgebung dient nur) und abgebildet mit dem Leica TCS SP5-Multiphotonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an der Advanced Analysis Centre an der University of Guelph. Abbildung 1 zeigt die kontrahierte und längliche Morphologie der Rac1 flox / flox Zellen, Adeno-Cre-Virus im Vergleich zu den gleichen Zellen nicht zu Virus ausgesetzt wurden ausgesetzt. Abbildung 1. Vergleich zwischen Rac1 flox / flox Zellen mit Adeno-Cre-Virus (links) im Vergleich zu nicht infizierten Zellen aus der gleichen Quelle (rechts) infiziert.