Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires

La décongélation des cellules Obtenir des fibroblastes de souris embryonnaires congelés (FAE) (généré précédemment à partir de cultures d'embryons individuels primaire) de l'azote liquide. Décongelez les cellules en plongeant le flacon dans l'eau 37 ° C en remuant jusqu'à ce contenu est complètement dégelée. Ajouter 9 ml de DMEM qui a été complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine à une plaque de culture cellulaire de 10cm. Ajouter la suspension cellulaire décongelée goutte à goutte à la plaque, le rock doucement la plaque pour disperser les cellules et les placer dans une plaque de 37 ° C CO, 5% 2 incubateur de la nuit. Notez que si les cellules sont sensibles à DMSO (à partir du processus de congélation), les médias initiale peut être remplacé par du milieu frais après que les cellules ont adhéré à la plaque (environ quatre heures après plaquage). Notez également que la confluence des cellules après décongélation dépend du nombre de cellules congelées, le taux de récupération des cellules après congélation, et le taux de croissance des cellules. Le repiquage des cellules Lorsque les cellules se sont développées essentiellement à 100% de confluence (ie: le lendemain), aspirer hors des médias et laver les cellules avec 5 ml de PBS stérile. Retirer du PBS et ajouter 1 ml de trypsine EDTA 10mM contenant et laisser reposer la plaque dans l'incubateur pendant environ 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque. Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter 9 ml de médias pour les cellules traitées à la trypsine, une pipette 2-3 fois pour disperser des bouquets, ajouter 1 ml de cette suspension goutte à goutte sur une nouvelle plaque contenant 9 ml de médias, et la place dans le présent 37 ° C durant la nuit incubateur . La présence de SVF dans les médias sera inactiver la trypsine variante, les cellules peuvent être d'abord lavé à diluer la trypsine. Comptage et le placage des cellules sur des lamelles Retirer les cellules de l'incubateur, les laver et trypsiniser comme avant, sauf que cette fois ajouter 5-6ml média retour aux cellules trypsinisées lieu de 9 ml. Cellules pipette soigneusement pour assurer la dissociation complète en une suspension cellulaire unique, et retirer 15μL à combiner avec 15μL du bleu trypan dans un tube de micro séparé. Mélanger cette suspension cellulaire / bleu trypan par pipetage de haut en bas plusieurs fois, et d'ajouter 15μL à l'hématimètre. Sous le microscope, les cellules mortes apparaissent bleues. Comptez le nombre de cellules claires / incolore (vivant) dans l'une des grilles 4X4 sur l'hématimètre. Répéter cette compter sur les trois grilles 4X4 autres (notés A, B, C et D) et utiliser l'équation suivante pour calculer le nombre de cellules par uL de suspension: Grâce à l'optimisation du protocole, nous avons déterminé que le placage 30000 résultats dans les cellules densité cellulaire appropriée pour la visualisation à l'issue de l'expérience. Pour calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour 30 000 cellules, utilisez l'équation suivante: Maintenant, placez un bordereau de verre stériles couvrent dans chaque puits d'un plat et ajouter six 2mL des médias dans chaque puits, puis ajouter goutte à goutte à partir de votre suspension cellulaire le volume requis pour 30.000 cellules dans chaque puits. Notez que des lamelles de verre sont utilisés pour cette expérience que nous serons visualisant les cellules en utilisant la microscopie à fluorescence à un stade ultérieur; toutes les applications ne seront nécessairement microscopie, et donc de couvrir glisse peut-être pas nécessaire. Transduction Virus Après plusieurs heures ou toute la nuit (un temps suffisant pour s'assurer que les cellules adhèrent au lamelles), retirez les médias et laver les cellules avec 1 ml de DMEM sans sérum. Ajouter 1 ml de milieu sans sérum dans chaque puits pour l'ajout du virus. Pour cette expérience, les virus adéno-Cre virus est obtenue commercialement à partir Biolabs Vector. Optimisation des protocoles antérieurs ont montré que la multiplicité d'infection (MOI) de 500 fournit transduction très efficace dans les primaires FAE avec peu ou aucun effet sur la viabilité cellulaire. MOI peut être calculée comme suit: Ajouter le volume calculé du virus directement dans chaque puits qui est d'être infectés, secouez légèrement la plaque pour disperser les cellules du virus et le placer dans l'incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain matin, enlever le virus milieux contenant des cellules et laver les cellules dans 1 ml de PBS stérile, puis ajouter 2 mL de médias régulièrement à chaque puits. Dans le cas de l'Rac1 cellules illustré dans cette expérience, les changements morphologiques survenus dans les cellules à environ 72 heures après la transduction. Les résultats représentatifs Les cellules ont été de visualiserD par coloration avec la phalloïdine actine colorant (à des fins d'imagerie uniquement) et imagée en utilisant le Leica TCS-SP5 microscope confocal à balayage laser multiphotonique au Centre d'analyse avancée à l'Université de Guelph. La figure 1 montre la morphologie contracté et allongée de la Rac1 flox / flox cellules qui ont été exposés à l'adénovirus Cre virus comparé aux mêmes cellules non exposées au virus. Figure 1. Comparaison entre Rac1 flox / flox cellules infectées par le virus adéno-Cre (à gauche) par rapport aux cellules non infectées de la même source (à droite).