Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

Celle di scongelamento Ottenere fibroblasti di topo embrioni congelati (MEF) (generato in precedenza da colture di singolo embrione primaria) da azoto liquido. Scongelare le cellule immergendo flaconcino in acqua a 37 ° C, rimestando fino a quando i contenuti sono completamente scongelati. Aggiungere 9 ml di DMEM che è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina ad una piastra di coltura cellulare 10 centimetri. Aggiungere la sospensione cellulare scongelati goccia a goccia alla piastra, il rock delicatamente la piastra per disperdere le cellule e conservare in un CO 37 ° C, 5% 2 incubatore notte. Si noti che se le cellule sono sensibili a DMSO (dal processo di congelamento), i media iniziale può essere sostituita con mezzi freschi dopo che le cellule hanno aderito alla piastra (circa quattro ore dopo la placcatura). Si noti inoltre che la confluenza delle cellule dopo lo scongelamento dipende dal numero di cellule congelate, il tasso di recupero delle cellule dopo il congelamento, e il tasso di crescita delle cellule. Cellule Passaging Quando le cellule sono cresciuti essenzialmente al 100% di confluenza (cioè il giorno successivo), aspirare al largo della media e lavare le cellule con 5 ml di PBS sterile. Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di tripsina contenente 10mM EDTA e conservare in incubatrice per circa 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dalla piastra. Quando le cellule sono staccati, aggiungere 9 ml di supporto alle cellule trypsinized, pipetta 2-3 volte per disperdere i grumi, aggiungere 1 ml di questa sospensione goccia a goccia su un piatto nuovo che contiene 9ml di media, e questo luogo nel 37 ° C durante la notte incubatore . La presenza di FBS nei media si inattivare la tripsina, in alternativa, le cellule possono essere lavati prima di diluire la tripsina. Conteggio e placcatura cellule su vetrini coprioggetto Rimuovere le cellule da incubatore, lavare e trypsinize come prima, ma questa volta aggiungere 5-6 ml mezzi di comunicazione di nuovo alle cellule trypsinized invece di 9 ml. Cellule pipetta a fondo per garantire la completa dissociazione in una sospensione singola cella, e rimuovere 15μL da abbinare a 15μL di tripano blu in una provetta per microcentrifuga separata. Mescolare questa cella / trypan sospensione blu pipettando su e giù parecchie volte, e aggiungere 15μL al emocitometro. Al microscopio, le cellule morte apparirà blu. Contare il numero di cellule chiare / incolore (vivente) in una delle griglie 4×4 sul emocitometro. Ripetere questa contare su tre griglie altri 4X4 (indicati A, B, C e D) e utilizzare la seguente equazione per calcolare il numero di cellule per ml di sospensione: Attraverso l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo stabilito che placcatura 30.000 risultati cellule della densità cella appropriata per la visualizzazione a conclusione dell'esperimento. Per calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per 30.000 celle, utilizzare la seguente equazione: Ora, mettere un coperchio di vetro sterile scivolare in ciascun pozzetto di un piatto ben sei e aggiungere 2 ml di media per ogni bene, e quindi aggiungere goccia a goccia dalla sospensione cellulare il volume necessario per 30.000 cellule in ciascun pozzetto. Si noti che scivola copertura in vetro vengono utilizzati per questo esperimento come saremo visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza in un punto secondo momento, non tutte le applicazioni saranno necessariamente microscopia, e quindi coprire scivola potrebbe non essere necessario. Trasduzione del virus Dopo diverse ore o durante la notte (tempo utile per assicurare che le cellule aderiscono al scivola copertina), rimuovere i supporti e lavare le cellule con 1 ml di DMEM senza siero. Aggiungere 1 ml di siero-media liberi in ciascun pozzetto per l'aggiunta del virus. Per questo esperimento, Cre adeno-virus è stato ottenuto commercialmente da Biolabs Vector. Ottimizzazione del protocollo precedente ha dimostrato che una molteplicità di infezione (MOI) di 500 offre trasduzione del gene altamente efficiente in primari MEF con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare. MOI può essere calcolato come segue: Aggiungere il volume calcolato di virus direttamente a ogni bene che deve essere infetto, agitare delicatamente la piastra per disperdere le cellule virus e posto in incubatore a 37 ° C durante la notte. La mattina successiva, rimuovere il virus contenente i media dalle cellule e lavare le cellule in 1 ml di PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di mezzi regolari per ciascun pozzetto. Nel caso delle cellule Rac1 esemplificato in questo esperimento, cambiamenti morfologici avvenuti nelle cellule in circa 72 ore di trasduzione del messaggio. Rappresentante Risultati Le cellule sono state visualizzated dalla colorazione con il colorante actina falloidina (per scopi di imaging solo) e ripreso con il TCS-SP5 Leica multiphoton microscopio confocale a scansione laser presso il Centro di analisi avanzata presso l'Università di Guelph. La figura 1 mostra la morfologia contratta e allungata del Rac1 flox / flox cellule che sono state esposte a virus adeno-Cre rispetto alle stesse cellule non esposte al virus. Figura 1. Confronto tra Rac1 flox / flox cellule infettate con virus adeno-Cre (a sinistra) rispetto a cellule non infettate dalla stessa fonte (a destra).