Overvågning af vævets mekaniske udvikling under neuralrørslukning af kyllingembryo

Neuralrørsdefekter (NTD'er) er alvorlige fødselsdefekter i centralnervesystemet forårsaget af fejl i neuralrørslukning (NTC) under embryonal udvikling¹. NTD'ernes ætiologi er kompleks. Undersøgelser har vist, at NTC involverer en sekvens af morfogenetiske processer, herunder konvergent forlængelse, bøjning af den neurale plade (fx apikal indsnævring), forhøjelse af den neurale fold og endelig vedhæftning af den neurale fold. Disse processer reguleres af flere molekylære og genetiske mekanismer ^2,3, og enhver funktionsfejl i disse processer kan resultere i NTD ^4,5,6. Da stigende beviser tyder på, at mekaniske signaler også spiller afgørende roller under NTC 3,7,8,9,10,11, og der er fundet forhold mellem gener og mekaniske signaler 12,13,14, bliver det bydende nødvendigt at undersøge vævsbiomekanikken under neurulering.

Der er udviklet flere teknikker til måling af embryonalt vævs mekaniske egenskaber, herunder laserablation (LA)¹⁵, vævsdissektion og afslapning (TDR)^16,17, mikropipetteaspiration (MA)¹⁸, Atomic Force Microscopy (AFM)-baseret nanoindrykning¹⁹, mikroindenter (MI) og mikroplader (MP)²⁰, mikroreologi (MR) med optisk/magnetisk pincet^21,22,23og dråbebaserede sensorer²⁴. Eksisterende metoder kan måle mekaniske egenskaber ved rumlige opløsninger, der spænder fra subcellulære til vævsskalaer. Imidlertid er de fleste af disse metoder invasive, fordi de kræver kontakt med prøven (f.eks. MA, AFM, MI og MP), ekstern materialeinjektion (f.eks. MR og dråbebaserede sensorer) eller vævsdissektion (f.eks. LA og TDR). Som følge heraf er det udfordrende for eksisterende metoder at overvåge den mekaniske udvikling af neuralt pladevæv in situ²⁵. For nylig har efterklang optisk kohærens elastografi vist lovende for berøringsfri mekanisk kortlægning med høj rumlig opløsning²⁶.

Konfokal Brillouin-mikroskopi er en ny optisk modalitet, der muliggør ikke-kontaktkvantificering af vævsbiomekanik med subcellulær opløsning 27,28,29,30. Brillouinmikroskopi er baseret på princippet om spontan Brillouin-lysspredning, som er interaktionen mellem det indfaldende laserlys og den akustiske bølge induceret af termiske udsving i materialet. Derfor oplever det spredte lys et frekvensskift, kendt som Brillouin-forskydningen ω_R, efter ligning³¹:

(1)

Her er materialets brydningsindeks, λ er bølgelængden af det indfaldende lys, M' er længdemodulet, ρ er massetætheden, og θ er vinklen mellem det indfaldende lys og det spredte lys. For samme type biologiske materialer er forholdet mellem brydningsindeks og densitet omtrent konstant 28,32,33,34,35,36. Således kan Brillouin-skiftet direkte bruges til at estimere relative mekaniske ændringer i fysiologiske processer. Gennemførligheden af Brillouin-mikroskopi er blevet valideret i forskellige biologiske prøver 29,37,38. For nylig blev time-lapse mekanisk billeddannelse af et levende kyllingembryo demonstreret ved at kombinere et Brillouin-mikroskop med et inkubationssystem på scenen³⁹. Denne protokol indeholder detaljerede beskrivelser af prøveforberedelse, eksperimentimplementering og dataefterbehandling og analyse. Vi håber, at denne indsats vil lette den udbredte anvendelse af berøringsfri Brillouin-teknologi til undersøgelse af biomekanisk regulering i embryoudvikling og fødselsdefekter.

Protokollen er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Wayne State University.

1. Eksperimentel forberedelse

1. Brug en 70% ethanolopløsning til at rengøre og sterilisere saks og pincet. Forbered også engangspipetter og en sprøjte.
2. Forbered et vaskemedium ved at tilsætte 3,595 g NaCl til 495 ml deioniseret vand. Derefter tilsættes 5 ml Penicillin-Streptomycin (5 E/ml) til mediet. Fyld et 100 mm petrifad med vaskemediet og varm det op til 37 °C.
3. Tilbered kulturretter i henhold til figur 1, som illustrerer den overordnede konfiguration.
   1. Forbered et stykke filterpapir, skær det i en rektangulær form på ca. 17 mm × 20 mm, og fjern de fire hjørner. Der oprettes et hult center i filterpapiret, ca. 7 mm × 10 mm til sikring af embryoet (figur 1, venstre).
      BEMÆRK: Indsamling af embryoner er beskrevet i trin 2.
   2. Fastgør en kommerciel tilgængelig ring (Φ = 1 tomme, se materialetabel) med et fleksibelt filmlag (dvs. paraffinfilm), hvilket sikrer, at den fleksible film også har et hult center. Denne ring med filmen vil blive brugt til at holde filterpapiret med embryoet.
   3. Til sidst anbringes den forberedte ring i en 35 mm petriskål (figur 1, højre).
      BEMÆRK: Filterpapiret er til sikring og fastholdelse af det ekstraherede embryo ved at placere filterpapiret på membranen og efterlade embryoet i det midterste hule område (som vil blive beskrevet i trin 2). De fire hjørner blev skåret for at passe til størrelsen på den udvendige ring (ikke nødvendigt, hvis den allerede er monteret). En 35 mm glasbundet kulturskål bruges til bedre laserstråleudbredelse. Fadet har en indre brønd (Φ = 23 mm), som kan fyldes med albumen til ex ovo-kultur . Ringens diameter skal være større end diameteren på den indre brønd, så brønden kan dækkes af den fleksible film på ringen (figur 1, indsats). Størrelsen på filterpapiret er ikke begrænset og kan ændres i henhold til størrelsen på den valgte ring og kulturskålen. Alternativt kan bunden af skålen forbelægges med et agaroselag (tykkelse: ~ 1 mm). Ved at fjerne agarose fra midten af laget ved hjælp af et blad kan der oprettes en brønd med en lignende form som det hule centrum af den fleksible film til ilægning af albumen. Et kritisk punkt er, at de fire sider af det hule filterpapir skal have tilstrækkelig bredde (> 5 mm) til at sikre fastgørelsen af embryoet.

2. Ekstraktion og ex ovo-dyrkning af kyllingeembryoet

BEMÆRK: Dette trin er ændret fra tidligere offentliggjorte rapporter^40,41.

1. Efter forkultur skal du hente ægget fra inkubatoren og placere det på sin lange akse på æggekartonbakken. Rengør æggeskallen med 70% ethanol, sørg for at dække hele overfladen, og lad den hvile i 15 minutter.
2. Hold ægget på sin korte akse og knæk det i bunden. Åbn ægget over en ren 100 mm petriskål for at trække indholdet ud, som vist i figur 2. Sørg for ikke at rotere ægget, mens du holder og revner det.
3. Ved hjælp af en pipette overføres og opsamles ca. 10 ml af det tynde albumen (dvs. det flydende albumen⁴²) i et 15 ml rør til ex ovo-kulturbrug . Fyld kulturskålens midterste brønd med det opsamlede tynde albumen (ca. 0,9 ml), som vist i figur 3. Påfyldningsprocessen skal være langsom og undgå dannelse af bobler inde i brønden. Sørg for, at kulturretten med albumen opvarmes til 37 °C.
   BEMÆRK: Denne skål vil blive brugt til dyrkning af embryoet ex ovo. Nye kulturskåle fyldt med vaskemedium vil blive brugt under Brillouin-billeddannelse (se trin 3).
4. Brug silkepapir til forsigtigt at fjerne det tykke albumen (dvs. tyktflydende albumen), der er fastgjort til embryoet, ved forsigtigt at adskille albumen fra vitellinmembranen, som vist i figur 4. Undgå direkte kontakt med vitellinmembranen.
5. Når du har fjernet alt det tykke albumen, skal du forsigtigt fastgøre filterpapiret til vitellinmembranen. Sørg for, at embryoets kropsakse flugter med den lange akse af midterrektanglet på filterpapiret. Brug en saks til at klippe membranen omkring filterpapiret.
6. Brug pincet til forsigtigt at trække det isolerede filterpapir væk fra æggeblommen i skrå retning. Vend filterpapiret på hovedet for at placere embryoet med ryggen nedad (til omvendt mikroskopkonfiguration). Nedsænk forsigtigt hele filterpapiret fra den ene side af den lange akse ned i 100 mm petriskålen med vaskemediet skråt.
7. Vask eventuelt resterende æggeblomme væk ved forsigtigt at sprøjte vaskemediet parallelt med filterpapiret med en ren pipette. Undgå at sprøjte vaskemediet direkte på membranen.
8. Når du har ryddet al æggeblommen, skal du forsigtigt fjerne filterpapiret fra vaskemediet og bruge silkepapir til at absorbere overskydende medium fra kanterne. Anbring derefter filterpapiret med embryoet på kulturskålen, og sørg for, at embryonets dorsale side vender nedad som vist i figur 5. For at opretholde fugtighed skal du placere et fugtet silkepapir i fadet.
9. Overfør kulturskålen til inkubatoren på scenen for ex ovo-kultur .

3. Brillouin måling af embryoet

1. Forbered et andet sæt kulturretter og fyld dem med vaskemedium. Sørg for, at vaskemediet er opvarmet til 37 °C.
2. Når embryoet når det ønskede udviklingsstadium, overføres filterpapiret med embryoet til kulturskålen fyldt med vaskemedium. Placer kulturskålen i Brillouin-mikroskopets inkubator på scenen (se materialetabel).
   1. Før du udfører Brillouin-målingen, skal du gemme et lysfeltbillede af hele embryoet som reference. Den detaljerede konfiguration af Brillouin-mikroskopet er tidligere beskrevet³⁰ og er opsummeret i afsnittet Resultater (figur 6).
3. Mål Brillouin-signalet for vand og methanol, som vil blive brugt i trin 4 til kalibreringsprocessen.
4. Juster kameraets eksponeringstid for indfaldende lasereffekt og elektronmultiplikerende ladningskoblet enhed (EMCCD, se materialetabel) for at opnå mindst 10.000 tællinger af Brillouin-signal. Brug lysfeltbilledet som vejledning til at indstille scanningsområdet og trinstørrelsen. Få et Brillouin-billede af interesseområdet ved at scanne embryoet ved hjælp af et 2D-translationelt trin.
   BEMÆRK: Det vandrette scanningsområde kan bestemmes ud fra lysfeltbilledet, og det lodrette scanningsområde (dvs. dybde) kan bestemmes ud fra signalstyrken opnået ved en hurtig og grov scanning. For at forhindre fotoskader på embryoet skal du begrænse den indfaldende effekt til 25 mW og indstille eksponeringstiden for EMCCD-kameraet til 50 ms. Vælg en trinstørrelse på 2 μm i vandret retning og 1 μm i lodret retning for at afbalancere billedkvalitet og anskaffelsestid.
5. Når scanningen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne filterpapiret med embryoet og bruge silkepapir til at absorbere overskydende vaskemedium. Placer derefter filterpapiret tilbage i kulturskålen fyldt med tyndt albumen til kontinuerlig dyrkning i inkubatoren på scenen.
6. Gentag trin 3.2-3.5 med regelmæssige tidsintervaller (f.eks. 1,5 timer) for at tage Brillouin-billeder med time-lapse, efterhånden som embryoet udvikler sig.
7. Rekonstruer 2D Brillouin-billedet ved at følge trin 4.

4. Brillouin billede rekonstruktion

1. Brillouin-spektrometeret kalibreres ved hjælp af Brillouin-signaler fra vand og methanol til beregning af det frie spektralområde (FSR) og pixel-til-frekvens-konverteringsforholdet (PR) for spektrometeret³⁰. De kalibrerede værdier for FSR og PR vil blive anvendt til at beregne embryoets Brillouin-forskydning ved hver pixel.
   BEMÆRK: Figur 7A viser et råt Brillouin-spektrum optaget af EMCCD-kameraet. Ved lodret summering af spektret og derefter en Lorentzian-tilpasning kan topafstanden Δd for de to prikker fås (figur 7B). Ved at få topafstanden for vand Δd_vand og methanol Δd_methanol kan FSR og PR beregnes ud fra ligningerne³⁰: PR = 2· (ω_{methanol-ω vand})/(Δd_vand- Δd_methanol) og FSR = 2·ω_vand + PR·Δd_vand, med den kendte Brillouin forskydning af vand ω_vand = 6,01 GHz og methanol ω_methanol = 4,49 GHz ved 660 nm.
2. Brillouin-signalets topafstand opnås ved hver pixel i prøven. Beregn Brillouin-skiftet baseret på den kalibrerede FSR og PR: ω_prøve = 0,5 (FSR - PR x_Δd-prøve)³⁰, hvor_ω-prøven er Brillouin-forskydningen af prøven, og_Δd-prøven er Brillouin-signalets topafstand.
3. Rekonstruer 2D Brillouin-billedet baseret på Brillouin-forskydningerne af alle pixels.
   BEMÆRK: For at udføre lokal analyse kan man vælge et område af interesse (f.eks. Neuralpladen) fra det erhvervede Brillouin-billede og kvantificere dets mekaniske egenskaber. En fælles tilgang er at beregne det gennemsnitlige Brillouin-skift i den valgte region.

Figur 6 viser skematisk af Brillouin-mikroskopet. Systemet anvender en 660 nm laser som lyskilde. En isolator placeres lige efter laserhovedet for at afvise ethvert tilbagereflekteret lys, og et neutralt densitetsfilter (ND) bruges til at justere lasereffekten. Et par linser, L1 og L2, med brændvidder på henholdsvis f1 = 16 mm og f2 = 100 mm, bruges til at udvide laserstrålen. En halvbølgeplade (HWP) og en lineær polarisator (Polarizer 1) anvendes til at justere effekten af strålen, der skinner på enten prøven eller kalibreringsmaterialerne (dvs. vand og methanol) efter den polariserede strålesplitter (PBS). For at fokusere laseren ind i prøven og indsamle bagudspredt lys anvendes en objektivlinse (OBJ2) med en numerisk blænde (NA) på 0,6 og en forstørrelse på 40. Det indfaldende lys og bagudspredt lys adskilles af den samme PBS efter polarisationsjustering ved hjælp af en kvartbølgeplade (QWP2). På samme måde bruges OBJ1 og QWP1 til at lede laserstrålen til kalibreringsmaterialerne. Brillouin-signalet leveres af en single-mode fiber til et Brillouin-spektrometer⁴³ til analyse. Inde i spektrometeret kobler en cylindrisk linse (C1) Brillouin-signalet ind i den første VIPA (virtuelt afbildet phased array) etalon. Outputtet fra den første VIPA etalon omformes af en anden cylindrisk linse (C2) og fokuseres på maske 1 for at afvise ikke-spredt laserlys. Derefter kobles Brillouin-signalet til en anden VIPA-etalon af en sfærisk linse (SL1), omformet af en anden sfærisk linse (SL2) og projiceres på maske 2. Det resulterende spektralmønster går derefter gennem en 4-f-enhed til støjafvisning og projiceres på en EMCCD til optagelse. Vi brugte et kommercielt mikroskop (se tabel over materialer). Generelt kan ethvert mikroskophus med forskellige mærker bruges, så længe det har en tilgængelig port til levering af den eksterne lysstråle. Inkubatoren på scenen er et metalkammer med temperatur-, gas- og luftstrømskontrol. Prøvens position justeres via det 2D-motoriserede trin. Et komplementært metaloxidhalvlederkamera (CMOS) bruges til at erhverve lysfeltbilledet.

Figur 8 viser time-lapse bright-field og Brillouin billeder af et repræsentativt kyllingeembryo. Embryoet blev ekstraheret efter 29 timer i ovo-kultur, og billederne blev taget ved 29 timer, 30,5 timer og 32 timer med ex ovo-kultur, hvilket svarer til somittal på henholdsvis 4, 5 og 8, henholdsvis⁴⁴. Generelt kan embryoet dyrkes i inkubatoren på scenen i mindst 24 timer. Den røde linje i det lyse feltbillede angiver placeringen af Brillouin-billeddannelsen. Med de erhvervede Brillouin-billeder blev det neurale pladeområde valgt (fremhævet med den sorte stiplede linje i figur 8) og beregnet det gennemsnitlige Brillouin-skift i dette område. Som vist i figur 9 øges den gennemsnitlige Brillouin-forskydning af vævet under neuralrørslukning. Længdemodulet beregnes også ud fra ligning (1), hvor værdien af = 1,3330 estimeres ud fra litteratur med zebrafiskembryoner⁴⁵, forudsat at værdien er relativt konstant for lignende typer biologiske væv^28,33.

Figur 1: Skematisk oversigt over hele kulturskålens konfiguration for embryonal udvikling. Denne figur viser et filterpapir til fastgørelse af embryoet til venstre og en 35 mm kulturskål med en ring fastgjort med et fleksibelt filmlag til højre. Tværsnitsskemaet leveres også. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Processen med at åbne æggeskallen over en ren 100 mm petriskål for at trække ægget ud i fadet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Fyldning af kulturskålens midterbrønd med tyndt albumin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Træk det tykke albumen væk i den retning, der er angivet med den røde pil, ved hjælp af et stykke silkepapir. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Placeringen af filterpapiret i kulturskålen med embryoet på forsiden af filterpapiret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Skematisk oversigt over Brillouin-mikroskopet. Den røde pil angiver laserstrålens lysbane, og den orange pil angiver lysbanen for Brillouin-signalet. L1, L2, SL1-SL4: sfærisk linse; SF: rumligt filter; C1, C2: cylindrisk linse, HWP: halvbølgeplade; PBS: polariseret strålesplitter; QWP1, QWP2: kvartbølgeplade; OBJ1, OBJ2: objektiv linse; LP: linsepar. VIPA: virtuelt afbildet faset array. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Repræsentativt Brillouin-signal. (A) Et repræsentativt Brillouin-spektrum fanget af EONN. (B) Et vertikalt opsummeret Brillouin-spektrum og tilsvarende Lorentzian-tilpasningsresultat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Lyse feltbilleder og de tilsvarende Brillouin-tværsnitsbilleder af embryoet ved 29 timer, 30,5 timer og 32 timer med 4, 5 og 8 somitter. Røde ubrudte linjer angiver placeringen af Brillouin-billeddannelse, og den sorte stiplede linje angiver den neurale pladeregion. Det grå område i 32 timers (8 somitter) billede er en artefakt af kurvetilpasning på grund af det svage Brillouin-signal og udelukkes ved beregning af det gennemsnitlige skift. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Brillouinforskydning og det estimerede længdemodul af neuralpladen mod somitantal og inkubationstid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den tidlige udvikling af embryoet kan let påvirkes af eksterne forstyrrelser. Der skal derfor udvises den største forsigtighed under ekstraktionen og overførslen af prøven. Et potentielt problem er frigørelsen af embryoet fra filterpapiret, hvilket kan føre til krympning af vitellinmembranen og resultere i en vippet artefakt af neuralpladen i Brillouin-billeddannelse. Desuden kan denne krympning standse udviklingen af embryoet. Der skal tages hensyn til flere kritiske trin for at forhindre løsrivelse. For det første er det i trin 2.4 afgørende at sikre grundig fjernelse af albumen fra membranoverfladen. Eventuelt resterende albumen kan hindre korrekt vedhæftning af membranen til filterpapiret^46,47. Derudover er det under vaskeprocessen vigtigt at sprøjte vaskemediet i en retning parallelt med membranen. Direkte at ramme membranen med væskestrømmen kan forårsage løsrivelse eller endda rive membranen. Desuden skal hele vaskeprocessen være afsluttet inden for kort tid (f.eks. <3 min), da langvarig nedsænkning også kan føre til, at embryoet løsner sig fra filterpapiret.

Før der udføres Brillouin-målinger, er det nødvendigt at overføre embryoet til en skål med vaskemedium. Dette skyldes, at Brillouin-skiftet i albumen er meget tæt på det neurale pladevæv, hvilket forårsager dårlig billedkontrast. Brillouin-billeddannelse opnås ved punktscanning, hvilket kan være tidskrævende, især når man beskæftiger sig med mange punkter. I denne protokol er scanningsområdet ca. 400 μm vandret og mindre end 100 μm lodret. For at undgå forstyrrelse af embryoets udvikling blev den samlede indsamlingstid begrænset til inden for 30 minutter. Dette opnås ved at udnytte en trinstørrelse på 2 μm vandret og 1 μm lodret. Hvis man kun er interesseret i det gennemsnitlige Brillouin-skift i en bestemt region, kan en hurtig og grov scanning (f.eks. med en trinstørrelse på 4 μm både vandret og lodret) implementeres, hvilket vil tage mindre end 5 minutter og kan afbøde den negative indvirkning på embryoudviklingen.

Brillouinmikroskopi tilbyder en realtids og ikke-invasiv billeddannelsesmetode til undersøgelse af biomekanikken i embryoudvikling. En begrænsning af denne metode ligger i dens penetrationsdybde, som er ca. 100-200 μm afhængigt af embryoets udviklingsstadium. Selvom en forøgelse af EONN's lasereffekt og/eller eksponeringstid delvist kan løse dette problem, sker det på bekostning af potentiel fototoksicitet og/eller lang anskaffelsestid. Alternativt kan eksisterende optiske teknologier, såsom adaptiv optik, potentielt anvendes til at forbedre penetrationsdybden⁴⁸.

Afslutningsvis har vi etableret en protokol til undersøgelse af de mekaniske egenskaber hos levende kyllingembryoner ved hjælp af Brillouin-mikroskopi. Denne kontaktfri metode kan opfylde nuværende uopfyldte behov og supplerer andre eksisterende værktøjer til undersøgelse af biomekanik i embryonal udvikling.