Summary

Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Este protocolo foi desenvolvido para monitorar longitudinalmente as propriedades mecânicas do tecido da placa neural durante a neurulação embrionária de pintinhos. Baseia-se na integração de um microscópio Brillouin e um sistema de incubação no estágio, permitindo imagens mecânicas ao vivo do tecido da placa neural em embriões de pintinhos cultivados ex ovo .

Abstract

O fechamento do tubo neural (NTC) é um processo crítico durante o desenvolvimento embrionário. A falha nesse processo pode levar a defeitos do tubo neural, causando malformações congênitas ou mesmo mortalidade. As NTC envolvem uma série de mecanismos em níveis genéticos, moleculares e mecânicos. Embora a regulação mecânica tenha se tornado um tópico cada vez mais atraente nos últimos anos, ela permanece em grande parte inexplorada devido à falta de tecnologia adequada para a realização de testes mecânicos de tecido embrionário 3D in situ. Em resposta, desenvolvemos um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas do tecido embrionário de galinhas de forma não invasiva e sem contato. Isto é conseguido através da integração de um microscópio Brillouin confocal com um sistema de incubação no palco. Para sondar a mecânica dos tecidos, um embrião pré-cultivado é coletado e transferido para uma incubadora no palco para cultura ex ovo . Simultaneamente, as imagens mecânicas do tecido da placa neural são adquiridas pelo microscópio Brillouin em diferentes momentos do desenvolvimento. Este protocolo inclui descrições detalhadas da preparação da amostra, a implementação de experimentos de microscopia de Brillouin e o pós-processamento e análise dos dados. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores podem estudar longitudinalmente a evolução mecânica do tecido embrionário durante o desenvolvimento.

Introduction

Os defeitos do tubo neural (DTN) são graves defeitos congênitos do sistema nervoso central causados por falhas no fechamento do tubo neural (NTC) durante o desenvolvimento embrionário1. A etiologia dos DTNs é complexa. Estudos têm mostrado que as NTC envolvem uma sequência de processos morfogenéticos, incluindo extensão convergente, flexão da placa neural (por exemplo, constrição apical), elevação da prega neural e, finalmente, adesão da prega neural. Esses processos são regulados por múltiplos mecanismos moleculares e genéticos 2,3, e qualquer mau funcionamento desses processos pode resultar em DTNs 4,5,6. Como evidências crescentes sugerem que pistas mecânicas também desempenham papéis cruciais durante as NTC3,7,8,9,10,11, e relações têm sido encontradas entre genes e pistas mecânicas 12,13,14, torna-se imperativo investigar a biomecânica tecidual durante a neurulação.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para medir as propriedades mecânicas de tecidos embrionários, incluindo ablação a laser (LA)15, dissecção e relaxamento tecidual (TDR)16,17, aspiração por micropipeta (MA)18, nanoindentação baseada em Microscopia de Força Atômica (AFM)19, microindenters (MI) e microplacas (MP)20, microrreologia (RM) com pinça óptica/magnética21,22,23e sensores baseados em gotículas24. Os métodos existentes podem medir propriedades mecânicas em resoluções espaciais que variam de escalas subcelulares a teciduais. No entanto, a maioria desses métodos é invasiva porque requer contato com a amostra (por exemplo, MA, AFM, MI e MP), injeção de material externo (por exemplo, MR e sensores baseados em gotículas) ou dissecção tecidual (por exemplo, LA e TDR). Como resultado, é um desafio para os métodos existentes monitorar a evolução mecânica do tecido da placa neural in situ25. Recentemente, a elastografia reverberante de coerência óptica tem se mostrado promissora para o mapeamento mecânico sem contato com alta resoluçãoespacial26.

A microscopia confocal de Brillouin é uma modalidade óptica emergente que permite a quantificação sem contato da biomecânica tecidual com resolução subcelular27,28,29,30. A microscopia de Brillouin baseia-se no princípio do espalhamento espontâneo da luz de Brillouin, que é a interação entre a luz laser incidente e a onda acústica induzida por flutuações térmicas no interior do material. Consequentemente, a luz espalhada experimenta um deslocamento de frequência, conhecido como deslocamento ωR de Brillouin, seguindo a equação31:

Equation 1 (1)

Aqui, Equation 2 é o índice de refração do material, λ é o comprimento de onda da luz incidente, M’ é o módulo longitudinal, ρ é a densidade de massa e θ é o ângulo entre a luz incidente e a luz espalhada. Para um mesmo tipo de material biológico, a relação entre índice de refração e densidade Equation 3 é aproximadamente constante 28,32,33,34,35,36. Assim, o desvio de Brillouin pode ser usado diretamente para estimar mudanças mecânicas relativas em processos fisiológicos. A viabilidade da microscopia de Brillouin foi validada em várias amostras biológicas 29,37,38. Recentemente, imagens mecânicas por lapso de tempo de um embrião de pintinho vivo foram demonstradas pela combinação de um microscópio Brillouin com um sistema de incubação no estágio39. Este protocolo fornece descrições detalhadas da preparação da amostra, implementação do experimento e pós-processamento e análise dos dados. Esperamos que este esforço facilite a adoção generalizada da tecnologia Brillouin sem contato para estudar a regulação biomecânica no desenvolvimento embrionário e defeitos congênitos.

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Wayne State University. 1. Preparação experimental Use uma solução de etanol a 70% para limpar e esterilizar a tesoura e pinça. Além disso, prepare pipetas descartáveis e uma seringa. Preparar um meio de lavagem adicionando 3,595 g de NaCl a 495 mL de água deionizada. Em seguida, adicionar 5 ml de Penicilina-Estreptomicina (5 U/mL) ao meio. Encha uma placa de Petri d…

Representative Results

A Figura 6 mostra o esquema do microscópio Brillouin. O sistema emprega um laser de 660 nm como fonte de luz. Um isolador é colocado logo após a cabeça do laser para rejeitar qualquer luz retro-refletida, e um filtro de densidade neutra (ND) é usado para ajustar a potência do laser. Um par de lentes, L1 e L2, com distâncias focais de f1 = 16 mm e f2 = 100 mm, respectivamente, são usados para expandir o feixe de laser. Uma placa de meia-onda (HWP) e um polarizador linear (Polarizador …

Discussion

O desenvolvimento inicial do embrião pode ser facilmente afetado por distúrbios externos. Portanto, é necessário o máximo de cautela durante a extração e transferência da amostra. Um problema potencial é o descolamento do embrião do papel de filtro, o que pode levar ao encolhimento da membrana vitelínica e resultar em um artefato inclinado da placa neural na imagem de Brillouin. Além disso, esse encolhimento pode interromper o desenvolvimento do embrião. Deve-se prestar atenção a várias etapas críticas p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

Materials

100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 

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Cite This Article
Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).

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