Summary

Monitoring van de mechanische evolutie van weefsel tijdens het sluiten van de neurale buis van kuikenembryo's

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Dit protocol is ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van neuraal plaatweefsel tijdens de neurulatie van kuikenembryo’s longitudinaal te monitoren. Het is gebaseerd op de integratie van een Brillouin-microscoop en een incubatiesysteem op het podium, waardoor live mechanische beeldvorming van neuraal plaatweefsel in ex ovo gekweekte kuikenembryo’s mogelijk wordt.

Abstract

Het sluiten van de neurale buis (NTC) is een cruciaal proces tijdens de embryonale ontwikkeling. Falen in dit proces kan leiden tot neurale buisdefecten, wat aangeboren misvormingen of zelfs sterfte veroorzaakt. NTC omvat een reeks mechanismen op genetisch, moleculair en mechanisch niveau. Hoewel mechanische regulering de laatste jaren een steeds aantrekkelijker onderwerp is geworden, blijft het grotendeels onontgonnen vanwege het gebrek aan geschikte technologie voor het uitvoeren van mechanische tests van 3D-embryonaal weefsel in situ. Als reactie hierop hebben we een protocol ontwikkeld om de mechanische eigenschappen van kippenembryonaal weefsel op een contactloze en niet-invasieve manier te kwantificeren. Dit wordt bereikt door een confocale Brillouin-microscoop te integreren met een incubatiesysteem op het podium. Om de weefselmechanica te onderzoeken, wordt een voorgekweekt embryo verzameld en overgebracht naar een incubator op het podium voor ex ovo-cultuur . Tegelijkertijd worden de mechanische beelden van het neurale plaatweefsel op verschillende tijdstippen tijdens de ontwikkeling door de Brillouin-microscoop verkregen. Dit protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de monstervoorbereiding, de implementatie van Brillouin-microscopie-experimenten en de nabewerking en analyse van gegevens. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers de mechanische evolutie van embryonaal weefsel tijdens de ontwikkeling longitudinaal bestuderen.

Introduction

Neurale buisdefecten (NTD’s) zijn ernstige geboorteafwijkingen van het centrale zenuwstelsel die worden veroorzaakt door storingen in de neurale buissluiting (NTC) tijdens de embryonale ontwikkeling1. De etiologie van NTD’s is complex. Studies hebben aangetoond dat NTC een opeenvolging van morfogenetische processen omvat, waaronder convergente extensie, buiging van de neurale plaat (bijv. apicale vernauwing), het verhogen van de neurale plooi en ten slotte adhesie van de neurale vouw. Deze processen worden gereguleerd door meerdere moleculaire en genetische mechanismen 2,3, en elke storing in deze processen kan leiden tot NTD’s 4,5,6. Aangezien er steeds meer bewijs is dat mechanische signalen ook een cruciale rol spelen tijdens NTC 3,7,8,9,10,11, en er relaties zijn gevonden tussen genen en mechanische signalen 12,13,14, wordt het noodzakelijk om de weefselbiomechanica tijdens neurulatie te onderzoeken.

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld voor het meten van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels, waaronder laserablatie (LA)15, weefseldissectie en -ontspanning (TDR)16,17, micropipetaspiratie (MA)18, nanoindentatie op basis van atoomkrachtmicroscopie (AFM)19, microindenters (MI) en microplaten (MP)20, microreologie (MR) met optisch/magnetisch pincet21,22,23, en druppelsensoren24. Bestaande methoden kunnen mechanische eigenschappen meten bij ruimtelijke resoluties, variërend van subcellulaire tot weefselschalen. De meeste van deze methoden zijn echter invasief omdat ze contact met het monster vereisen (bijv. MA, AFM, MI en MP), externe materiaalinjectie (bijv. MR en druppelgebaseerde sensoren) of weefseldissectie (bijv. LA en TDR). Als gevolg hiervan is het voor bestaande methoden een uitdaging om de mechanische evolutie van neuraal plaatweefsel in situte volgen 25. Onlangs is galmende optische coherentie-elastografie veelbelovend gebleken voor contactloze mechanische mapping met een hoge ruimtelijke resolutie26.

Confocale Brillouin-microscopie is een opkomende optische modaliteit die contactloze kwantificering van weefselbiomechanica mogelijk maakt met een subcellulaire resolutievan 27,28,29,30. Brillouin-microscopie is gebaseerd op het principe van spontane Brillouin-lichtverstrooiing, de interactie tussen het invallende laserlicht en de akoestische golf die wordt veroorzaakt door thermische fluctuaties in het materiaal. Bijgevolg ondergaat het verstrooide licht een frequentieverschuiving, bekend als de Brillouin-verschuiving ωR, volgens de vergelijking31:

Equation 1 (1)

Hier is de brekingsindex van het materiaal, Equation 2 λ is de golflengte van het invallende licht, M’ is de longitudinale modulus, ρ is de massadichtheid en θ is de hoek tussen het invallende licht en het verstrooide licht. Voor hetzelfde type biologische materialen is de verhouding tussen brekingsindex en dichtheid Equation 3 ongeveer constant 28,32,33,34,35,36. De Brillouin-verschuiving kan dus direct worden gebruikt om relatieve mechanische veranderingen in fysiologische processen te schatten. De haalbaarheid van Brillouin-microscopie is gevalideerd in verschillende biologische monsters 29,37,38. Onlangs werd time-lapse mechanische beeldvorming van een levend kuikenembryo gedemonstreerd door een Brillouin-microscoop te combineren met een incubatiesysteem op het podium39. Dit protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de voorbereiding van het monster, de uitvoering van het experiment en de nabewerking en analyse van gegevens. We hopen dat deze inspanning de wijdverbreide acceptatie van contactloze Brillouin-technologie zal vergemakkelijken voor het bestuderen van biomechanische regulatie in de ontwikkeling van embryo’s en geboorteafwijkingen.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Wayne State University. 1. Experimentele voorbereiding Gebruik een 70% ethanoloplossing om de schaar en het pincet schoon te maken en te steriliseren. Maak ook wegwerppipetten en een spuit klaar. Bereid een wasmedium voor door 3.595 g NaCl toe te voegen aan 495 ml gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 5 ml penicilline-streptomycine (5 E/ml) toe aan het medium. Vul een petris…

Representative Results

Figuur 6 toont het schema van de Brillouin microscoop. Het systeem maakt gebruik van een 660 nm laser als lichtbron. Direct na de laserkop wordt een isolator geplaatst om teruggekaatst licht af te weren, en een ND-filter (Neutral Density) wordt gebruikt om het laservermogen aan te passen. Een paar lenzen, L1 en L2, met brandpuntsafstanden van respectievelijk f1 = 16 mm en f2 = 100 mm, worden gebruikt om de laserstraal uit te breiden. Een halfgolfplaat (HWP) en een lineaire polarisator (polar…

Discussion

De vroege ontwikkeling van het embryo kan gemakkelijk worden beïnvloed door externe verstoringen. Daarom is uiterste voorzichtigheid geboden tijdens de monsterextractie en -overdracht. Een mogelijk probleem is het loskomen van het embryo van het filterpapier, wat kan leiden tot het krimpen van het vitelline-membraan en kan resulteren in een gekanteld artefact van de neurale plaat in Brillouin-beeldvorming. Bovendien kan dit krimpen de ontwikkeling van het embryo stoppen. Er moet aandacht worden besteed aan verschillende…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

Materials

100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 

References

  1. Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
  2. Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
  3. Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
  4. Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
  5. Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
  6. Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
  7. Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
  8. Moon, L. D., Xiong, F. Mechanics of neural tube morphogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).
  9. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
  10. De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
  11. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
  12. Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
  13. Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
  14. Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
  15. Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , 128-147 (2015).
  16. Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
  17. Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
  18. Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  19. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
  20. Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
  21. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
  22. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
  23. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
  25. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
  26. Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
  27. Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
  28. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  29. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  30. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  31. Boyd, R. W. . Nonlinear optics. , (2020).
  32. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  33. Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
  34. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
  35. Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
  36. Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
  37. Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
  38. Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
  39. Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
  40. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
  41. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
  42. Nys, Y., Guyot, N., Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. . Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. , 83-132 (2011).
  43. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
  44. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  45. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  46. Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  47. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  48. Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).

Play Video

Cite This Article
Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).

View Video