Övervakning av den mekaniska utvecklingen av vävnad under neuralrörsstängning av kycklingembryo

Neuralrörsdefekter (NTD) är allvarliga fosterskador i det centrala nervsystemet som orsakas av fel i neuralrörsstängningen (NTC) under embryonal utveckling¹. Etiologin för NTD är komplex. Studier har visat att NTC involverar en sekvens av morfogenetiska processer, inklusive konvergent förlängning, böjning av neuralplattan (t.ex. apikal sammandragning), höjning av neuralvecket och slutligen vidhäftning av neuralvecket. Dessa processer regleras av flera molekylära och genetiska mekanismer ^2,3, och eventuella fel i dessa processer kan resultera i NTD ^4,5,6. Eftersom allt fler bevis tyder på att mekaniska signaler också spelar avgörande roller under NTC 3,7,8,9,10,11^, och relationer har hittats mellan gener och mekaniska signaler 12,13,14, blir det absolut nödvändigt att undersöka vävnadens biomekanik under neurulation.

Flera tekniker har utvecklats för att mäta de mekaniska egenskaperna hos embryonala vävnader, inklusive laserablation (LA)¹⁵, vävnadsdissektion och relaxation (TDR)^16,17, mikropipettaspiration (MA)¹⁸, atomkraftsmikroskopi (AFM)-baserad nanoindentation¹⁹, mikroindenters (MI) och mikroplattor (MP)²⁰, mikroreologi (MR) med optisk/magnetisk pincett 21,22,23 och droppbaserade sensorer²⁴. Befintliga metoder kan mäta mekaniska egenskaper vid rumsliga upplösningar som sträcker sig från subcellulära till vävnadsskalor. De flesta av dessa metoder är dock invasiva eftersom de kräver kontakt med provet (t.ex. MA, AFM, MI och MP), injektion av externt material (t.ex. MR och droppbaserade sensorer) eller vävnadsdissektion (t.ex. LA och TDR). Som ett resultat är det utmanande för befintliga metoder att övervaka den mekaniska utvecklingen av neuralplattevävnad in situ²⁵. Nyligen har efterklangselastografi med optisk koherens visat sig lovande för beröringsfri mekanisk kartläggning med hög rumslig upplösning²⁶.

Konfokal Brillouin-mikroskopi är en framväxande optisk modalitet som möjliggör beröringsfri kvantifiering av vävnadsbiomekanik med subcellulär upplösning 27,28,29,30. Brillouinmikroskopi bygger på principen om spontan Brillouin-ljusspridning, vilket är interaktionen mellan det infallande laserljuset och den akustiska vågen som induceras av termiska fluktuationer i materialet. Följaktligen upplever det spridda ljuset ett frekvensskifte, känt som Brillouin-skiftet ω_R, enligt ekvation³¹:

(1)

Här är materialets brytningsindex, λ är våglängden för det infallande ljuset, M’ är den längsgående modulen, ρ är massdensiteten och θ är vinkeln mellan det infallande ljuset och det spridda ljuset. För samma typ av biologiska material är förhållandet mellan brytningsindex och densitet ungefär konstant 28,32,33,34,35,36. Således kan Brillouin-skiftet direkt användas för att uppskatta relativa mekaniska förändringar i fysiologiska processer. Genomförbarheten av Brillouin-mikroskopi har validerats i olika biologiska prover 29,37,38. Nyligen demonstrerades time-lapse mekanisk avbildning av ett levande kycklingembryo genom att kombinera ett Brillouin-mikroskop med ett inkubationssystem^{på scenen 39}. Detta protokoll innehåller detaljerade beskrivningar av provberedning, experimentimplementering och efterbearbetning och analys av data. Vi hoppas att denna insats kommer att underlätta en utbredd användning av beröringsfri Brillouin-teknik för att studera biomekanisk reglering i embryoutveckling och fosterskador.