JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

Civciv Embriyosunun Nöral Tüp Kapanması Sırasında Dokunun Mekanik Gelişiminin İzlenmesi

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/66117
, , ,
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

Bu protokol, civciv embriyo nörülasyonu sırasında nöral plak dokusunun mekanik özelliklerini uzunlamasına izlemek için geliştirilmiştir. Bir Brillouin mikroskobu ve bir sahne inkübasyon sisteminin entegrasyonuna dayanır ve ex ovo kültürlenmiş civciv embriyolarında nöral plaka dokusunun canlı mekanik görüntülemesini sağlar.

Abstract

Nöral tüp kapanması (NTC), embriyonik gelişim sırasında kritik bir süreçtir. Bu süreçteki başarısızlık, nöral tüp defektlerine yol açarak konjenital malformasyonlara ve hatta mortaliteye neden olabilir. NTC, genetik, moleküler ve mekanik seviyelerde bir dizi mekanizma içerir. Mekanik düzenleme son yıllarda giderek daha çekici bir konu haline gelse de, 3D embriyonik dokunun yerinde mekanik testini yapmak için uygun teknolojinin bulunmaması nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş durumda. Buna cevaben, tavuk embriyonik dokusunun mekanik özelliklerini temassız ve invaziv olmayan bir şekilde ölçmek için bir protokol geliştirdik. Bu, konfokal bir Brillouin mikroskobunun sahnede bir inkübasyon sistemi ile entegre edilmesiyle elde edilir. Doku mekaniğini araştırmak için, önceden kültürlenmiş bir embriyo toplanır ve ex ovo kültür için sahnedeki bir inkübatöre aktarılır. Eşzamanlı olarak, nöral plak dokusunun mekanik görüntüleri, gelişim sırasında farklı zaman noktalarında Brillouin mikroskobu tarafından elde edilir. Bu protokol, numune hazırlama, Brillouin mikroskobu deneylerinin uygulanması ve veri işleme sonrası ve analizinin ayrıntılı açıklamalarını içerir. Bu protokolü izleyerek, araştırmacılar gelişim sırasında embriyonik dokunun mekanik evrimini uzunlamasına inceleyebilirler.

Introduction

Nöral tüp defektleri (NTD’ler), embriyonik gelişim sırasında nöral tüp kapanmasındaki (NTC) başarısızlıkların neden olduğu merkezi sinir sisteminin ciddi doğum kusurlarıdır1. NTD’lerin etiyolojisi karmaşıktır. Çalışmalar, NTC’nin yakınsak uzantı, nöral plakanın bükülmesi (örneğin, apikal daralma), nöral kıvrımın yükseltilmesi ve son olarak nöral kıvrımın yapışması dahil olmak üzere bir dizi morfogenetik süreci içerdiğini göstermiştir. Bu süreçler çoklu moleküler ve genetik mekanizmalar 2,3 tarafından düzenlenir ve bu süreçlerdeki herhangi bir arıza NTD’lere 4,5,6 neden olabilir. Artan kanıtlar, NTC 3,7,8,9,10,11 sırasında mekanik ipuçlarının da çok önemli roller oynadığını ve genler ile mekanik ipuçları 12,13,14 arasında ilişkiler bulunduğunu gösterdiğinden, nörülasyon sırasında doku biyomekaniğinin araştırılması zorunlu hale gelir.

Embriyonik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için lazer ablasyon (LA)15, doku diseksiyonu ve gevşemesi (TDR)16,17, mikropipet aspirasyonu (MA)18, Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) tabanlı nanoindentasyon19, mikroindenterler (MI) ve mikroplakalar (MP)20, optik/manyetik cımbızlı mikro reoloji (MR) 21,22,23 dahil olmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştirve damlacık tabanlı sensörler24. Mevcut yöntemler, hücre altından doku ölçeklerine kadar değişen uzamsal çözünürlüklerde mekanik özellikleri ölçebilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu invazivdir, çünkü numune ile temas (örneğin, MA, AFM, MI ve MP), harici malzeme enjeksiyonu (örneğin, MR ve damlacık tabanlı sensörler) veya doku diseksiyonu (örneğin, LA ve TDR). Sonuç olarak, mevcut yöntemlerin nöral plak dokusunun mekanik gelişimini in situ25 izlemesi zordur. Son zamanlarda, yankılanan optik koherens elastografi, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip temassız mekanik haritalama için umut vaat etmektedir26.

Konfokal Brillouin mikroskobu, subselüler çözünürlük 27,28,29,30 ile doku biyomekaniğinin temassız kantitalitesini sağlayan yeni bir optik modalitedir. Brillouin mikroskobu, gelen lazer ışığı ile malzeme içindeki termal dalgalanmaların neden olduğu akustik dalga arasındaki etkileşim olan spontan Brillouin ışık saçılımı ilkesine dayanır. Sonuç olarak, saçılan ışık, denklem31’i takiben Brillouin kayması ωR olarak bilinen bir frekans kayması yaşar:

Equation 1 (1)

Burada, Equation 2 malzemenin kırılma indisi, λ gelen ışığın dalga boyu, M’ uzunlamasına modül, ρ kütle yoğunluğu ve θ gelen ışık ile saçılan ışık arasındaki açıdır. Aynı tip biyolojik materyaller için kırılma indisi ve yoğunluk Equation 3 oranı yaklaşık olaraksabittir 28,32,33,34,35,36. Bu nedenle, Brillouin kayması, fizyolojik süreçlerdeki göreceli mekanik değişiklikleri tahmin etmek için doğrudan kullanılabilir. Brillouin mikroskobunun fizibilitesi çeşitli biyolojik örneklerde doğrulanmıştır 29,37,38. Son zamanlarda, canlı bir civciv embriyosunun hızlandırılmış mekanik görüntülemesi, bir Brillouin mikroskobu ile sahnede bir inkübasyon sistemi39 birleştirilerek gösterildi. Bu protokol, numune hazırlama, deney uygulaması ve veri işleme ve analizi hakkında ayrıntılı açıklamalar sağlar. Bu çabanın, embriyo gelişimi ve doğum kusurlarında biyomekanik düzenlemeyi incelemek için temassız Brillouin teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.

Protocol

Protokol, Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. Deneysel hazırlık Makas ve cımbızı temizlemek ve sterilize etmek için etanol solüsyonu kullanın. Ayrıca, tek kullanımlık pipetler ve bir şırınga hazırlayın. 495 mL deiyonize suya 3.595 g NaCl ekleyerek bir yıkama ortamı hazırlayın. Daha sonra ortama 5 ml Penisilin-Streptomisin (5 U/mL) ekleyin. 100 mm’lik bir Petri kabını yı…

Representative Results

Şekil 6 , Brillouin mikroskobunun şemasını göstermektedir. Sistem, ışık kaynağı olarak 660 nm’lik bir lazer kullanır. Geri yansıyan ışığı reddetmek için lazer kafasının hemen arkasına bir izolatör yerleştirilir ve lazer gücünü ayarlamak için bir nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanılır. Lazer ışınını genişletmek için odak uzaklığı sırasıyla f1 = 16 mm ve f2 = 100 mm olan bir çift lens, L1 ve L2 kullanılır. Polarize ışın ayırıcıdan (PBS) sonra…

Discussion

Embriyonun erken gelişimi dış rahatsızlıklardan kolayca etkilenebilir. Bu nedenle, numune ekstraksiyonu ve transferi sırasında çok dikkatli olunmalıdır. Potansiyel bir sorun, embriyonun filtre kağıdından ayrılmasıdır, bu da vitellin zarının büzülmesine yol açabilir ve Brillouin görüntülemede nöral plakanın eğik bir artefaktına neden olabilir. Ayrıca, bu küçülme embriyonun gelişimini durdurabilir. Ayrılmayı önlemek için birkaç kritik adıma dikkat edilmelidir. İlk olarak, adım 2.4’t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri (K25HD097288, R21HD112663) tarafından desteklenmektedir.

Materials

100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
  2. Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
  3. Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
  4. Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
  5. Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
  6. Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
  7. Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
  8. Moon, L. D., Xiong, F. Mechanics of neural tube morphogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).
  9. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
  10. De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
  11. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
  12. Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
  13. Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
  14. Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
  15. Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , 128-147 (2015).
  16. Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
  17. Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
  18. Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  19. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
  20. Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
  21. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
  22. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
  23. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
  25. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
  26. Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
  27. Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
  28. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  29. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  30. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  31. Boyd, R. W. . Nonlinear optics. , (2020).
  32. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  33. Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
  34. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
  35. Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
  36. Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
  37. Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
  38. Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
  39. Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
  40. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
  41. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
  42. Nys, Y., Guyot, N., Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. . Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. , 83-132 (2011).
  43. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
  44. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  45. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  46. Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  47. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  48. Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).

Tags

Neural Tube ClosureChick EmbryoBrillouin MicroscopyNon-contactNon-invasiveEmbryonic DevelopmentMorphogenesisNeural Tube Defects

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image