Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell’embrione di pulcino. Si basa sull’integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l’imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .
La chiusura del tubo neurale (NTC) è un processo critico durante lo sviluppo embrionale. Il fallimento di questo processo può portare a difetti del tubo neurale, causando malformazioni congenite o addirittura la mortalità. L’NTC coinvolge una serie di meccanismi a livello genetico, molecolare e meccanico. Sebbene la regolazione meccanica sia diventata un argomento sempre più interessante negli ultimi anni, rimane in gran parte inesplorata a causa della mancanza di una tecnologia adeguata per condurre test meccanici del tessuto embrionale 3D in situ. In risposta, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche del tessuto embrionale di pollo in modo non invasivo e senza contatto. Ciò si ottiene integrando un microscopio confocale Brillouin con un sistema di incubazione sul palco. Per sondare la meccanica dei tessuti, un embrione pre-coltivato viene raccolto e trasferito in un’incubatrice sul palco per la coltura ex ovo . Allo stesso tempo, le immagini meccaniche del tessuto della placca neurale vengono acquisite dal microscopio Brillouin in diversi momenti durante lo sviluppo. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione del campione, l’implementazione degli esperimenti di microscopia di Brillouin e la post-elaborazione e l’analisi dei dati. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono studiare longitudinalmente l’evoluzione meccanica del tessuto embrionale durante lo sviluppo.
I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale1. L’eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l’NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l’estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l’elevazione della piega neurale e infine l’adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici 2,3 e qualsiasi malfunzionamento in questi processi può provocare NTD 4,5,6. Poiché prove crescenti suggeriscono che anche i segnali meccanici svolgono un ruolo cruciale durante le NTC 3,7,8,9,10,11 e sono state trovate relazioni tra geni e segnali meccanici 12,13,14, diventa imperativo studiare la biomeccanica dei tessuti durante la neurulazione.
Sono state sviluppate diverse tecniche per misurare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali, tra cui l’ablazione laser (LA)15, la dissezione e il rilassamento tissutale (TDR)16,17, l’aspirazione con micropipette (MA)18, la nanoindentazione basata sulla microscopia a forza atomica (AFM)19, i micropenetratori (MI) e le micropiastre (MP)20, la microreologia (MR) con pinzette ottiche/magnetiche 21,22,23e sensori basati su goccioline24. I metodi esistenti sono in grado di misurare le proprietà meccaniche a risoluzioni spaziali che vanno dalle scale subcellulari a quelle tissutali. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono invasivi perché richiedono il contatto con il campione (ad es. MA, AFM, MI e MP), l’iniezione di materiale esterno (ad es. MR e sensori basati su goccioline) o la dissezione tissutale (ad es. LA e TDR). Di conseguenza, è difficile per i metodi esistenti monitorare l’evoluzione meccanica del tessuto della placca neurale in situ25. Recentemente, l’elastografia a coerenza ottica riverberante si è dimostrata promettente per la mappatura meccanica senza contatto ad alta risoluzionespaziale 26.
La microscopia confocale Brillouin è una modalità ottica emergente che consente la quantificazione senza contatto della biomeccanica tissutale con risoluzione subcellulare 27,28,29,30. La microscopia di Brillouin si basa sul principio della diffusione spontanea della luce di Brillouin, che è l’interazione tra la luce laser incidente e l’onda acustica indotta dalle fluttuazioni termiche all’interno del materiale. Di conseguenza, la luce diffusa subisce uno spostamento di frequenza, noto come spostamento di Brillouin ωR, seguendo l’equazione31:
(1)
Qui, è l’indice di rifrazione del materiale, λ è la lunghezza d’onda della luce incidente, M’ è il modulo longitudinale, ρ è la densità di massa e θ è l’angolo tra la luce incidente e la luce diffusa. Per lo stesso tipo di materiali biologici, il rapporto tra indice di rifrazione e densità è approssimativamente costante 28,32,33,34,35,36. Pertanto, lo spostamento di Brillouin può essere utilizzato direttamente per stimare i cambiamenti meccanici relativi nei processi fisiologici. La fattibilità della microscopia di Brillouin è stata convalidata in vari campioni biologici 29,37,38. Recentemente, è stata dimostrata l’imaging meccanico time-lapse di un embrione di pulcino vivo combinando un microscopio Brillouin con un sistema di incubazione sul palco39. Questo protocollo fornisce descrizioni dettagliate della preparazione del campione, dell’implementazione dell’esperimento, della post-elaborazione e dell’analisi dei dati. Ci auguriamo che questo sforzo faciliti l’adozione diffusa della tecnologia Brillouin senza contatto per lo studio della regolazione biomeccanica nello sviluppo embrionale e nei difetti alla nascita.
Lo sviluppo precoce dell’embrione può essere facilmente influenzato da disturbi esterni. Pertanto, è necessaria la massima cautela durante l’estrazione e il trasferimento del campione. Un potenziale problema è il distacco dell’embrione dalla carta da filtro, che può portare al restringimento della membrana vitellina e provocare un artefatto inclinato della placca neurale nell’imaging di Brillouin. Inoltre, questo restringimento può arrestare lo sviluppo dell’embrione. È necessario prestare attenzione a diversi pass…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è sostenuto dall’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).
100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
EMCCD camera | Andor | iXon | |
Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
Ring | Thorlabs | SM1RR | |
Microscope body | Olympus | IX73 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
Syringe | BD | 305482 | |
Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
Tube | Corning | 430052 | |
Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |