Overvåking av mekanisk utvikling av vev under nevralrørslukning av kyllingembryo

Nevralrørsdefekter (NTD) er alvorlige fødselsskader i sentralnervesystemet forårsaket av svikt i nevralrørslukning (NTC) under embryonal utvikling¹. Etiologien til NTD er kompleks. Studier har vist at NTC involverer en sekvens av morfogenetiske prosesser, inkludert konvergent forlengelse, bøyning av nevrale platen (f.eks. Apikal innsnevring), heving av nevrale fold og til slutt vedheft av nevrale fold. Disse prosessene reguleres av flere molekylære og genetiske mekanismer ^2,3, og enhver funksjonsfeil i disse prosessene kan resultere i NTD ^4,5,6. Som montering bevis tyder på at mekaniske signaler også spiller avgjørende roller under NTC 3,7,8,9,10,11, og forhold har blitt funnet mellom gener og mekaniske signaler 12,13,14, blir det viktig å undersøke vevsbiomekanikken under neurulasjon.

Flere teknikker er utviklet for å måle de mekaniske egenskapene til embryonale vev, inkludert laserablasjon (LA)¹⁵, vevsdisseksjon og relaksasjon (TDR)^16,17, mikropipetteaspirasjon (MA)¹⁸, atomkraftmikroskopi (AFM)-basert nanoindentasjon¹⁹, mikroindenter (MI) og mikroplater (MP)²⁰, mikroreologi (MR) med optisk/magnetisk pinsett^21,22,23, og dråpebaserte sensorer²⁴. Eksisterende metoder kan måle mekaniske egenskaper ved romlige oppløsninger som spenner fra subcellulære til vevsskalaer. Imidlertid er de fleste av disse metodene invasive fordi de krever kontakt med prøven (f.eks. MA, AFM, MI og MP), injeksjon av eksternt materiale (f.eks. MR og dråpebaserte sensorer) eller vevsdisseksjon (f.eks. LA og TDR). Som et resultat er det utfordrende for eksisterende metoder å overvåke den mekaniske utviklingen av nevrale platevev in situ²⁵. Nylig har reverberant optisk koherens elastografi vist løfte om ikke-kontakt mekanisk kartlegging med høy romlig oppløsning²⁶.

Konfokal Brillouin-mikroskopi er en fremvoksende optisk modalitet som muliggjør ikke-kontaktkvantifisering av vevsbiomekanikk med subcellulær oppløsning 27,28,29,30. Brillouin-mikroskopi er basert på prinsippet om spontan Brillouin-lysspredning, som er vekselvirkningen mellom det innfallende laserlyset og den akustiske bølgen indusert av termiske fluktuasjoner i materialet. Følgelig opplever det spredte lyset en frekvensforskyvning, kjent som Brillouin-skiftet ω_R, etter ligningen³¹:

(1)

Her er brytningsindeksen til materialet, λ er bølgelengden til det innfallende lyset, M’ er lengdemodulen, ρ er massetettheten, og θ er vinkelen mellom det innfallende lyset og det spredte lyset. For samme type biologiske materialer er forholdet mellom brytningsindeks og tetthet omtrent konstant 28,32,33,34,35,36. Dermed kan Brillouin-skiftet brukes direkte til å estimere relative mekaniske endringer i fysiologiske prosesser. Gjennomførbarheten av Brillouin-mikroskopi er validert i forskjellige biologiske prøver 29,37,38. Nylig ble time-lapse mekanisk avbildning av et levende kyllingembryo demonstrert ved å kombinere et Brillouin-mikroskop med et inkubasjonssystem på scenen³⁹. Denne protokollen gir detaljerte beskrivelser av prøvepreparering, eksperimentimplementering og etterbehandling og analyse av data. Vi håper denne innsatsen vil legge til rette for utbredt bruk av ikke-kontakt Brillouin-teknologi for å studere biomekanisk regulering i embryoutvikling og fødselsskader.