Überwachung der mechanischen Entwicklung von Gewebe während des Neuralrohrverschlusses des Kükenembryos

Neuralrohrdefekte (NTDs) sind schwere Geburtsfehler des zentralen Nervensystems, die durch Störungen des Neuralrohrverschlusses (NTC) während der Embryonalentwicklung verursacht^{werden 1}. Die Ätiologie von NTDs ist komplex. Studien haben gezeigt, dass NTC eine Abfolge morphogenetischer Prozesse beinhaltet, einschließlich konvergenter Ausdehnung, Biegung der Neuralplatte (z. B. apikale Verengung), Anhebung der Neuralfalte und schließlich Adhäsion der Neuralfalte. Diese Prozesse werden durch mehrere molekulare und genetische Mechanismen reguliert ^2,3, und jede Fehlfunktion dieser Prozesse kann zu NTDs führen ^4,5,6. Da sich die Beweise häufen, dass mechanische Signale auch während NTC^eine entscheidende Rolle spielen 3,7,8,9,10,11 und Beziehungen zwischen Genen und mechanischen Hinweisen gefunden wurden 12,13,14, ist es unerlässlich, die Biomechanik des Gewebes während der Neurulation zu untersuchen.

Zur Messung der mechanischen Eigenschaften von embryonalem Gewebe wurden verschiedene Techniken entwickelt, darunter Laserablation (LA)¹⁵, Gewebedissektion und -entspannung (TDR)^16,17, Mikropipettenaspiration (MA)¹⁸, Rasterkraftmikroskopie (AFM)-basierte Nanoindentation¹⁹, Mikroeindringkörper (MI) und Mikrotiterplatten (MP)²⁰, Mikrorheologie (MR) mit optischer/magnetischer Pinzette 21,22,23und tröpfchenbasierte Sensoren²⁴. Bestehende Methoden können mechanische Eigenschaften mit räumlichen Auflösungen messen, die von subzellulären bis hin zu Gewebemaßstäben reichen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch invasiv, da sie Kontakt mit der Probe (z. B. MA, AFM, MI und MP), externe Materialinjektion (z. B. MR- und tröpfchenbasierte Sensoren) oder Gewebedissektion (z. B. LA und TDR) erfordern. Infolgedessen ist es für bestehende Methoden eine Herausforderung, die mechanische Entwicklung von Neuralplattengewebe in situ^{zu überwachen 25}. In jüngster Zeit hat sich die nachhallende optische Kohärenz-Elastographie als vielversprechend für die berührungslose mechanische Kartierung mit hoher räumlicher Auflösung erwiesen²⁶.

Die konfokale Brillouin-Mikroskopie ist eine aufstrebende optische Modalität, die eine berührungslose Quantifizierung der Gewebebiomechanik mit subzellulärer Auflösung^ermöglicht 27,28,29,30. Die Brillouin-Mikroskopie basiert auf dem Prinzip der spontanen Brillouin-Lichtstreuung, also der Wechselwirkung zwischen dem einfallenden Laserlicht und der durch thermische Fluktuationen im Material induzierten Schallwelle. Folglich erfährt das Streulicht eine Frequenzverschiebung, die als Brillouin-Verschiebung ω_R bekannt ist, nach der Gleichung³¹:

(1)

Hier ist der Brechungsindex des Materials, λ ist die Wellenlänge des einfallenden Lichts, M’ ist der Längsmodul, ρ ist die Massendichte und θ ist der Winkel zwischen dem einfallenden Licht und dem Streulicht. Für die gleiche Art von biologischem Material ist das Verhältnis von Brechungsindex und Dichte ungefähr^konstant 28,32,33,34,35,36. Somit kann die Brillouin-Verschiebung direkt verwendet werden, um relative mechanische Veränderungen physiologischer Prozesse abzuschätzen. Die Durchführbarkeit der Brillouin-Mikroskopie wurde in verschiedenen biologischen Proben validiert 29,37,38. Kürzlich wurde die mechanische Bildgebung eines lebenden Kükenembryos im Zeitraffer demonstriert, indem ein Brillouin-Mikroskop mit einem Inkubationssystem auf der Bühne^{kombiniert wurde 39}. Dieses Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der Probenvorbereitung, der Durchführung von Experimenten sowie der Datennachbearbeitung und -analyse. Wir hoffen, dass diese Bemühungen die weit verbreitete Einführung der berührungslosen Brillouin-Technologie zur Untersuchung der biomechanischen Regulation bei Embryonalentwicklung und Geburtsfehlern erleichtern werden.