Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Chenjun Shi; Chenchen Handler; Haden Florn; Jitao Zhang

doi:10.3791/66117

JoVE Journal > Developmental Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

발생학

चूजे भ्रूण के तंत्रिका ट्यूब बंद होने के दौरान ऊतक के यांत्रिक विकास की निगरानी

Published: November 10, 2023

doi:

10.3791/66117

Chenjun Shi, Chenchen Handler, Haden Florn, Jitao Zhang

¹Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Wayne State University, ²Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

इस प्रोटोकॉल को चूजे भ्रूण तंत्रिका के दौरान तंत्रिका प्लेट ऊतक के यांत्रिक गुणों की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए विकसित किया गया था। यह एक ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप और एक ऑन-स्टेज इनक्यूबेशन सिस्टम के एकीकरण पर आधारित है, जो पूर्व ओवो सुसंस्कृत चूजे भ्रूण में तंत्रिका प्लेट ऊतक की लाइव मैकेनिकल इमेजिंग को सक्षम करता है।

Abstract

भ्रूण के विकास के दौरान तंत्रिका ट्यूब बंद (एनटीसी) एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया में विफलता से तंत्रिका ट्यूब दोष हो सकते हैं, जिससे जन्मजात विकृतियां या मृत्यु दर भी हो सकती है। एनटीसी में आनुवंशिक, आणविक और यांत्रिक स्तरों पर तंत्र की एक श्रृंखला शामिल है। जबकि हाल के वर्षों में यांत्रिक विनियमन एक तेजी से आकर्षक विषय बन गया है, यह सीटू में 3 डी भ्रूण ऊतक के यांत्रिक परीक्षण के संचालन के लिए उपयुक्त तकनीक की कमी के कारण काफी हद तक अस्पष्टीकृत है। जवाब में, हमने गैर-संपर्क और गैर-आक्रामक तरीके से चिकन भ्रूण ऊतक के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह एक मंच पर इनक्यूबेशन प्रणाली के साथ एक confocal Brillouin माइक्रोस्कोप को एकीकृत करके हासिल की है. ऊतक यांत्रिकी की जांच करने के लिए, एक पूर्व सुसंस्कृत भ्रूण एकत्र किया जाता है और पूर्व ovo संस्कृति के लिए एक मंच पर इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरित. इसके साथ ही, तंत्रिका प्लेट ऊतक की यांत्रिक छवियों को विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल नमूना तैयार करने, Brillouin माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के कार्यान्वयन, और डेटा के बाद प्रसंस्करण और विश्लेषण के विस्तृत विवरण भी शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ताओं अनुदैर्ध्य विकास के दौरान भ्रूण ऊतक के यांत्रिक विकास का अध्ययन कर सकते हैं.

Introduction

तंत्रिका ट्यूब दोष (एनटीडी) भ्रूण के विकास के दौरान तंत्रिका ट्यूब बंद (एनटीसी) में विफलताओं के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के गंभीर जन्म दोष हैं¹. एनटीडी का एटियलजि जटिल है। अध्ययनों से पता चला है कि एनटीसी में मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं का एक क्रम शामिल है, जिसमें अभिसरण विस्तार, तंत्रिका प्लेट का झुकना (जैसे, शिखर कसना), तंत्रिका गुना को ऊपर उठाना, और अंत में तंत्रिका गुना का आसंजन शामिल है। इन प्रक्रियाओं को कई आणविक और आनुवंशिक तंत्र ^2,3 द्वारा विनियमित कर रहे हैं, और इन प्रक्रियाओं में किसी भी खराबी एनटीडी ^4,5,6 में परिणाम हो सकता ^है. बढ़ते सबूत के रूप में पता चलता है कि यांत्रिक संकेत भी एनटीसी 3,7,8,9,10,11 के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और जीन और यांत्रिक संकेत 12,13,14के बीच संबंध पाए गए हैं, यह तंत्रिका के दौरान ऊतक बायोमैकेनिक्स की जांच करने के लिए अनिवार्य हो जाता है।

लेजर पृथक्करण (एलए)¹⁵, ऊतक विच्छेदन और विश्राम (टीडीआर)^16,17, माइक्रोपिपेट आकांक्षा (एमए)¹⁸, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)-आधारित नैनोइंडेंटेशन¹⁹, माइक्रोइंडेंटर्स (एमआई) और माइक्रोप्लेट्स (एमपी)²⁰, ऑप्टिकल/चुंबकीय चिमटी^21,22,23 के साथ माइक्रो रियोलॉजी (एमआर) सहित भ्रूण के ऊतकों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, और ड्रॉपलेट-आधारित सेंसर²⁴. मौजूदा तरीके उपकोशिकीय से ऊतक तराजू तक के स्थानिक प्रस्तावों पर यांत्रिक गुणों को माप सकते हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां आक्रामक हैं क्योंकि उन्हें नमूने (जैसे, एमए, एएफएम, एमआई और एमपी), बाहरी सामग्री इंजेक्शन (जैसे, एमआर और बूंद-आधारित सेंसर), या ऊतक विच्छेदन (जैसे, एलए और टीडीआर) के संपर्क की आवश्यकता होती है। नतीजतन, यह सीटू²⁵ में तंत्रिका प्लेट ऊतक के यांत्रिक विकास की निगरानी करने के लिए मौजूदा तरीकों के लिए चुनौतीपूर्ण है. हाल ही में, reverberant ऑप्टिकल जुटना इलास्टोग्राफी उच्च स्थानिक संकल्प²⁶ के साथ गैर संपर्क यांत्रिक मानचित्रण के लिए वादा दिखाया गया है.

कॉन्फोकल ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी एक उभरती हुई ऑप्टिकल साधन है जो उपकोशिकीय संकल्प ^{27,28,29,30के} साथ ऊतक बायोमैकेनिक्स के गैर-संपर्क मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता ^है। ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी सहज ब्रिलौइन प्रकाश प्रकीर्णन के सिद्धांत पर आधारित है, जो घटना लेजर प्रकाश और सामग्री के भीतर थर्मल उतार-चढ़ाव से प्रेरित ध्वनिक लहर के बीच बातचीत है। नतीजतन, प्रकीर्णित प्रकाश एक आवृत्ति बदलाव का अनुभव करता है, जिसे समीकरण³¹ के बाद ब्रिलौइन शिफ्ट ω_आर के रूप में जाना जाता है:

(1)

यहाँ, पदार्थ का अपवर्तनांक है, λ आपतित प्रकाश की तरंगदैर्घ्य है, M’ अनुदैर्ध्य मापांक है, ρ द्रव्यमान घनत्व है, और θ आपतित प्रकाश और प्रकीर्णित प्रकाश के बीच का कोण है। एक ही प्रकार की जैविक सामग्री के लिए, अपवर्तक सूचकांक और घनत्व का अनुपात लगभग 28,32,33,34,35,36 है। इस प्रकार, ब्रिलौइन शिफ्ट का उपयोग सीधे शारीरिक प्रक्रियाओं में सापेक्ष यांत्रिक परिवर्तनों का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी की व्यवहार्यता विभिन्न जैविक नमूनों 29,37,38में मान्य किया गया है. हाल ही में, एक जीवित लड़की भ्रूण के समय चूक यांत्रिक इमेजिंग एक मंच पर इनक्यूबेशन प्रणाली³⁹ के साथ एक Brillouin खुर्दबीन के संयोजन से प्रदर्शन किया गया था. यह प्रोटोकॉल नमूना तैयार करने, प्रयोग कार्यान्वयन, और डेटा के बाद प्रसंस्करण और विश्लेषण के विस्तृत विवरण प्रदान करता है. हमें उम्मीद है कि यह प्रयास भ्रूण के विकास और जन्म दोषों में बायोमेकेनिकल विनियमन का अध्ययन करने के लिए गैर-संपर्क ब्रिलौइन प्रौद्योगिकी को व्यापक रूप से अपनाने की सुविधा प्रदान करेगा।

Protocol

प्रोटोकॉल को वेन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। 1. प्रायोगिक तैयारी कैंची और चिमटी को साफ और निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल समाध?…

Representative Results

चित्रा 6 ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप के योजनाबद्ध से पता चलता है. सिस्टम प्रकाश स्रोत के रूप में 660 एनएम लेजर को नियोजित करता है। किसी भी बैक-परावर्तित प्रकाश को अस्वीकार करने के लिए लेजर हेड के ठी?…

Discussion

भ्रूण का प्रारंभिक विकास बाहरी गड़बड़ी से आसानी से प्रभावित हो सकता है। इसलिए, नमूना निष्कर्षण और हस्तांतरण के दौरान अत्यधिक सावधानी की आवश्यकता होती है। एक संभावित मुद्दा फिल्टर पेपर से भ्रूण की टु?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (K25HD097288, R21HD112663) द्वारा समर्थित है।

Materials

100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set

References

Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
Moon, L. D., Xiong, F. Mechanics of neural tube morphogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).
Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , 128-147 (2015).
Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
Boyd, R. W. . Nonlinear optics. , (2020).
Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
Nys, Y., Guyot, N., Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. . Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. , 83-132 (2011).
Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).