Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.
Son yıllarda, Zebra balığı embriyo rahim embriyo gelişimi ve optik şeffaflık gibi özellikleri nedeniyle gelişim biyolojisi eğitim için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Zebra balığı embriyo omurgalı böbrek organogenesis yanı sıra multiciliated hücre (mm) gelişimini incelemek için önemli bir organizma haline gelmiştir. Embriyonik Zebra balığı böbrek MCCs görselleştirmek için bütün Dağı Floresan situ hibridizasyon (balık) kombine bir protokol geliştirdik ve tüm yüksek kararlılık düşsel sağlayan ayirt (Eğer) mount. Bu el yazması RNA transkript ve protein birlikte gelişim programları aracılığıyla çeşitli soy faktörleri ifade Yönetmeliği daha iyi anlamak için bir araç olarak yerelleştirme için bizim teknik anlatılmaktadır.
Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) gelişim biyolojisi çalışmak için ana model organizma ortaya çıkmıştır. Embriyoların anne dışında geliştirmek ve optik saydamdır. Ayrıca, göz, böbrek ve ön gibi hayati organların oluşumunu hızla, sadece 24 saat sonrası döllenme tarafından (hpf) oluşan yapılar ile oluşur. Önemlisi, Zebra balığı genom son derece memeliler1,2,3ile korunmuş. Ayrıca, Zebra balığı ve memeli organları benzer anatomisi ve fizyolojisi olması. Zebra balığı embriyonik böbrek veya pronephros, erken nephrogenesis ve korunmuş epitel hücre popülasyonlarının omurgalı nefron4, kader tayini sırasında gen fonksiyon incelenmesi için modeli sistem değerini gösterir 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. benzer şekilde, Zebra balığı embriyo MCCs11,12,13,14,15, ontogeny incelerken giderek daha önemli hale gelmiştir 16 , 17.
Onların adından da anlaşılacağı gibi MCCs epitel hücrelerinin apikal yüzey17tarihinde yer alan hareketli kirpikler bir bohça ile karakterize vardır. Zebra balığı, MCCs sıvı akışı çalışması ve 24 hpf11,12,13,14tarafından, pronephros her nefron yarısı boyunca moda gibi bir “salt-and-pepper” içinde dağınık 15 , 16 , 17. her ne kadar onlar sadece bir avuç dikkat edilmiştir insan böbrek hastalığı18,19,20,21durumlarda, MCCs yaygın beyin gibi memeli diğer dokularda ve deneysel tasarım zorluklar bir dizi pozlar Trakea22,23,24. Zarif Zebra balığı da dahil olmak üzere çeşitli omurgalı modelleri çalışmalarda mm kaderin korunmuş bir patika yol mm geliştirme12,17,25 bir inhibitörü olarak sinyal çentik ile göstermiştir ,26,27. Bu nedenle, Zebra balığı pronephros mm geliştirme vivo içinde11,12,13,14, genetik mekanizmaları incelemek için kolayca erişilebilir modeli sağlar 15 , 16 , 17.
Şeffaflık ve genetik manipülasyon kolay: Zebra balığı embriyoların hücre kaderi, doku büyüme ve gelişme erken embriyo1,2 düzenleyen genetik ve moleküler yolları okurken çok değerli özellikleri olduğu kanıtlanmıştır ,3. Situ hibridizasyon ve bütün Dağı Eğer gibi protein ve gen transkript görselleştirmek, edilmiş uygulanan ve Zebra balığı16,28,29içinen iyi duruma getirilmiş için böyle, geleneksel teknikleri, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Balık ve eğer için popüler iletişim kuralları birleştirerek, etiket ve MM’ler vivo16,28,37,38analiz etmek mümkündür.
Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralı pronephros odf3b transkriptler ve α-tübülin içinde 24 hpf Zebra balığı embriyo ile MCCs etiketleme için optimize edilmiştir. En iyi sonuçlar için bu taze sabit ve hazırlanmış embriyo kullanmak için tavsiye edilir. Ama istenmeyen arka plan boyama ile embriyo depolama biriminde tutulur zaman artar olasılığı sabit ve ya MeOH veya Hyb + bir haftadan uzun-20 ° C’de saklanan embriyolar kullanılabilir.
Değişiklikler ve bu tekniğin sorun giderme bu yöntem diğer suites özel işaretleri, örneğin diğer antianlamlı riboprobes ve diğer antikorları için terzi gereklidir. Bütün Dağı in situ hibridizasyon sürecinde adımları parametrelerini ayarlamak için pek çok yöntem olmuştur daha önce31,34,36,38, bizim grup ve diğerleri tarafından belgelenen 39. Aynı şekilde, her protein antikoru bazı kere boyama açısından sorun giderme gerektirecektir ve dilutions ve kuluçka süreleri her birincil antikor için yaklaşık aralıkları en iyi belgelenmiş sonuçları28, değerlendirilmesi tarafından tahmin edilir 35. embriyo 24 genç için hpf, pK tedavi 2 dk kısa olmalıdır nerede embriyo 24 büyük hpf pK 2 dk daha uzun süre ile tedavi. Ayrıca, embriyo 24 büyük hpf pigment pK tedavi öncesi ağartılmış.
Floresan boyama çözüm ile boyama sonra kalan leke, antikor ve peroxidases metanol ve hidrojen peroksit yıkar dizi gerçekleştirerek kaldırmak için önemlidir. Hemen ardından PBS yıkar aşırı metanol embriyo kaldırmak için hayati önem taşımaktadır. Önemlisi, eğer antikorlar ile devam etmeden önce biz daha az bir başka ve/veya santrifüj tüpleri için uygun olasılığı embriyoların yapmak aseton ve deiyonize suyla yıkama bulduk. Bizim deneyim, antikorlar belirli transkripsiyon faktörleri ve diğer genler için onlar verimli çalışabilir olsa Western engelliyor, Zebra balığı Eğer için iyi çalışmıyor. Ancak, α-tübülin ve β-catenin, gibi son derece korunmuş ve bol protein de Zebra balığı Eğer16,37için çalışır.
Balık ile henüz belirli antikor içinde Zebra balığı var mı genler RNA Tutanaklar görselleştirmek mümkündür. Balık Eğer ile birleştirerek, bu iletişim kuralı tarafından gösterildiği gibi protein ve RNA transkript co yerelleştirme görülen vivo içinde (Şekil 2) olabilir. Esnek doğası çeşitli RNA transkriptler ve proteinler arasında çok sayıda doku ve zaman Puan görselleştirme için hızlı sorun giderme sağlar. Zebra balığı embriyo zaten saygın özellikleri ile birleştirildiğinde, bu iletişim kuralı balık + Eğer genler ve proteinler önemli ifade gelişimsel yolu düzenleme için keşfetmek için başka bir araç sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser kısmen R.A.W. ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu No R01DK100237 grant tarafından desteklenmiştir DGE-1313583 A.N.M. için Ayrıca üniversite, bilim yaz lisans araştırma bursu programı M.U. destek için teşekkür ederiz Bizim Zebra balığı özel onların bakımı için University of Notre Dame, Zebra balığı Araştırma Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Biyolojik Bilimler Bölümü üyeleri laboratuarımızın tüm destek ve değerli bakış açısı için teşekkür etmek istiyoruz.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |