أهداب التنمية أمر حيوي ل organogenesis السليم. ويصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل التسمية ووضع تصور لخلايا عضو من الزرد.
وفي السنوات الأخيرة، برز الجنين الزرد كنموذج شعبية لدراسة علم الأحياء التنموي بسبب الصفات مثل تطوير الأجنة خارج الرحم والشفافية الضوئية. على وجه الخصوص، أصبح الجنين الزرد كائن هامة لدراسة organogenesis الكلي الفقارية، فضلا عن تطوير الخلية مولتيسيلياتيد (MCC). تصور MCCs في الكلي الجنينية الزرد، وضعت بروتوكولا مجتمعة من الجامعة-جبل الفلورسنت في الموقع التهجين (الأسماك)، وجبل كاملة الفلورة (إذا كان) التي تمكن من التصوير بدقة عالية. ويصف هذه المخطوطة لدينا للمشترك ترجمة النصوص الرنا والبروتين كأداة فهم أفضل لتنظيم البرامج الإنمائية من خلال التعبير عن مختلف النسب عوامل التقنية.
على مدى العقود العديدة الماضية، برز الزرد (دانيو rerio) ككائن نموذج رئيس الوزراء لدراسة علم الأحياء التنموي. وضع خارج الأم الأجنة وهي شفافة بصريا. أيضا، يحدث تشكيل الأجهزة الحيوية في الجسم مثل العين والكلى، وفوريبراين بسرعة، مع هياكل تشكلت قبل 24 ساعة فقط بعد الإخصاب (hpf). الأهم من ذلك، هو الغاية حفظت الجينوم الزرد مع الثدييات1،،من23. بالإضافة إلى ذلك، قد الزرد والثدييات أجهزة مماثلة من التشريح وعلم وظائف الأعضاء. الكلي الجنينية الزرد، أو برونيفروس، يوضح قيمة النظام النموذجي لفحص وظيفة الجينات أثناء نيفروجينيسيس المبكر وتحديد مصير السكان الخلايا الظهارية المصانة كليون الفقارية4، 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وبالمثل، أصبح الجنين الزرد متزايد الأهمية في دراسة أونتوجيني MCCs11،،من1213،14،15، 16 , 17.
وكما يوحي اسمها، هي MCCs الخلايا الظهارية التي تتميز بحزمة من أهداب متحركة الموجود على سطح قمي17. في الزرد، MCCs تعمل في تدفق السوائل، ومشتتة في “سالتاندبيبير” مثل الأزياء في جميع أنحاء منتصف كل نفرون من برونيفروس واسطة 24 هبف11،،من1213،14، 15 , 16 , 17-على الرغم من أنهم يلاحظ إلا في حفنة حالات مرض الكلي البشرية18،19،،من2021، وتنتشر مراكز مراقبة الرحلات في أنسجة الثدييات الأخرى مثل المخ و القصبة الهوائية22،،من2324، الذي يطرح مجموعة من التحديات للتصميم التجريبي. وقد أثبتت الدراسات أنيقة في مختلف النماذج الفقاريات، بما في ذلك الزرد طريقا مصانة من مصير لجنة التنسيق الإداري، مع الشق مما يشير إلى المسار كمثبط لجنة التنسيق الإداري التنمية12،17،25 ،،من2627. ولذلك، يوفر برونيفروس الزرد نموذج الوصول إليها بسهولة دراسة الآليات الوراثية من لجنة التنسيق الإداري التنمية في فيفو11،،من1213،14، 15 , 16 , 17.
الشفافية وسهولة التلاعب الجيني للأجنة الزرد أثبتت أن الصفات لا تقدر بثمن عند دراسة المسارات الجينية والجزيئية التي تنظم مصير الخلية والأنسجة النمو والتنمية وقت مبكر الجنين1،2 ،3. كهذه، التقنيات التقليدية تصور النصوص البروتينات والجينات، مثل التهجين في الموقع ، وإذا كان جبل كله، وتم تطبيقها على والأمثل لالزرد16،،من2829، 30،31،32،،من3334،35،36،،من3738. عن طريق الجمع بين البروتوكولات شعبية للأسماك، وإذا كان، فمن الممكن وصف وتحليل MCCs في فيفو16،28،،من3738.
البروتوكول بالتفصيل أعلاه هو الأمثل لوسم MCCs في برونيفروس مع النصوص odf3b و α-tubulin في 24 هبف الزرد الأجنة. للحصول على أفضل النتائج، من المستحسن استخدام أجنة طازجة الثابتة واستعداد. ويمكن استخدام الأجنة التي تم إصلاحها والمخزنة في ميوه أو هيب + في-20 درجة مئوية لمدة أطول من أسبوع واحد، لكن احتمال خلفية غير المرغوب فيه تلطيخ يزداد مع الوقت الذي يتم الاحتفاظ الأجنة في مخزن.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه التقنية ضرورية لتكييف هذا الأسلوب لمجموعات أخرى من علامات معينة، مثل ريبوبروبيس العقاقير الأخرى وغيرها من الأجسام المضادة. العديد من الأساليب لضبط معلمات خطوات عملية جبل كله التهجين في الموقع قد تم توثيقها مسبقاً من مجموعتنا وغيرها31،34،،من3638، 39. وبالمثل، كل جسم البروتين سوف تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها فيما يتعلق تلطيخ مرات، ونطاقات التقريبي لتخفيف ومرات حضانة لكل جسم الأولية تقدر أفضل تقييم للنتائج الموثقة28، 35-للأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 هبف، ينبغي أن تكون المعاملة pK أقصر من 2 دقيقة، حيث الأجنة تزيد أعمارهم عن 24 هبف ينبغي أن تعامل مع pK لمدة أطول من 2 دقيقة. كما أن الأجنة تزيد أعمارهم عن 24 ينبغي المبيضة هبف الصباغ قبل العلاج pK.
بعد تلطيخ مع الحل المصبوغة الفلورسنت، من المهم لإزالة أي تبقى وصمة عار وجسم، وبيروكسيداسيس عن طريق إجراء سلسلة يغسل الميثانول وفوق أكسيد الهيدروجين. يغسل برنامج تلفزيوني فور ذات أهمية حيوية لإزالة الميثانول الزائدة من الأجنة. الأهم من ذلك، قبل المتابعة مع الأجسام المضادة إذا، وجدنا أن الأسيتون ويغسل المياه تجعل الأجنة أقل احتمالاً للتمسك ببعضها البعض و/أو أنابيب الطرد المركزي. في التجربة، والأجسام المضادة لعوامل النسخ المحددة وجينات أخرى، على الرغم من أنهم قد العمل بكفاءة في اسطوانات الغربية يقوم، لا تعمل بشكل جيد إذا كان في الزرد. ومع ذلك، العمل المصانة عاليا، ووفرة البروتينات، مثل α-tubulin وبيتا-كاتينين، جيدا في الزرد لحالة16،37.
مع الأسماك، فإنه من الممكن تصور النصوص الحمض النووي الريبي للجينات التي لا تملك بعد الأجسام المضادة المحددة في الزرد. من خلال الجمع بين السمك مع IF، كما يتبين من هذا البروتوكول، يمكن أن يكون التعريب المشارك من البروتين والحمض النووي الريبي النصوص ينظر في فيفو (الشكل 2). الطابع المرن للبروتوكول يتيح استكشاف الأخطاء وإصلاحها سريعاً للتصور من النصوص الجيش الملكي النيبالي والبروتينات في العديد من الأنسجة والنقاط الزمنية المختلفة. عندما جنبا إلى جنب مع سمات الفعل احترام الأجنة الزرد، يوفر هذا البروتوكول من الأسماك + إذا أداة أخرى لاستكشاف التعبير عن الجينات والبروتينات الهامة لتنظيم المسار التنموي.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح R01DK100237 R.A.W. و “الوطنية العلم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالات رقم” DGE-1313583 إلى A.N.M. ونشكر أيضا كلية “العلوم الصيف الجامعية بحوث برنامج المنح” لدعم م نود أن نشكر المركز الزرد البحوث في جامعة نوتردام لرعايتهم مكرسة لأعمالنا الزرد. كما نود أن نشكر قسم “العلوم البيولوجية”، فضلا عن أعضاء لدينا مختبر للجميع لدعمهم وأفكاراً قيمة.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |