Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.
In den letzten Jahren entstanden die Zebrafish Embryos als ein beliebtes Modell, Entwicklungsbiologie durch Merkmale wie ex Utero Embryonalentwicklung und optische Transparenz zu studieren. Insbesondere geworden Zebrafish Embryos Organismus wichtiger vertebrate Niere Organogenese sowie multiciliated Zellentwicklung (MCC) zu studieren. Um MCCs in der embryonalen Zebrafisch-Niere zu visualisieren, haben wir entwickelt ein kombiniertes Protokoll der gesamten-Mount Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) und ganze montieren Immunfluoreszenz (IF), die hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Dieses Manuskript beschreibt unsere Technik zur Lokalisierung Co RNA-Transkripte und Protein als Instrument zur Regulierung der Entwicklungsprogramme durch die Expression verschiedener Abstammung Faktoren besser zu verstehen.
In den letzten Jahrzehnten entstanden der Zebrabärbling (Danio Rerio) als bester Modellorganismus Entwicklungsbiologie zu studieren. Die Embryonen entwickeln außerhalb der Mutter und sind optisch transparent. Außerdem tritt die Bildung der lebenswichtigen Organe wie Auge, Niere und Vorderhirn schnell, mit Strukturen von nur 24 h Post Düngung (hpf) gebildet. Wichtig ist, ist das Zebrafish Genom mit Säugetiere1,2,3hoch konserviert. Darüber hinaus haben Zebrafisch und Säugetieren Organe ähnliche Anatomie und Physiologie. Die Zebrafish embryonale Nieren- oder Pronephros, zeigt den Wert des Modellsystems zur Prüfung Genfunktion während der frühen Nephrogenesis und Schicksal Bestimmung der konservierten epithelialen Zell-Populationen von Wirbeltieren Nephron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ebenso Zebrafish Embryos wird immer wichtiger bei der Prüfung der Ontogenese MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Wie der Name schon sagt, sind MCCs Epithelzellen zeichnet sich durch ein Bündel von bewegliche Cilien befindet sich auf der apikalen Oberfläche17. In der Zebrabärbling MCCs in Flüssigkeitsströmung funktionieren und sind in ein “Pfeffer” wie Mode in der Mitte jedes Nephron der Pronephros zerstreut durch 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. obwohl sie nur in einer Handvoll aufgefallen der menschlichen Niere Krankheit Fällen18,19,20,21, MCCs sind weit verbreitet in anderen Säugetieren Geweben wie dem Gehirn und Luftröhre22,23,24, die eine Vielzahl von Herausforderungen für experimentelles Design darstellt. Elegante Studien verschiedene vertebrate Modelle einschließlich Zebrafisch haben einen erhaltenen Weg von MCC Schicksal, mit der Notch-Signalweg als Inhibitor der MCC Entwicklung12,17,25 gezeigt. ,26,27. Daher stellt der Zebrafisch Pronephros eine leicht zugängliche Modell zur Untersuchung der genetischen Mechanismen der MCC Entwicklung in Vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparenz und einfache genetische Manipulation von Zebrafisch-Embryonen erwiesen sich als unschätzbare Eigenschaften sein, wenn die genetischen und molekularen Wege zu studieren, die Schicksal der Zelle, Gewebewachstum und Entwicklung des frühen Embryos1,2 regulieren ,3. Als solcher, traditionelle Techniken, um Protein und gen Transkripte, z. B. in Situ Hybridisierung und ganze Berg wenn zu visualisieren, angewendet und optimiert wurden der Zebrafisch16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Durch die Kombination von beliebten Protokolle für Fisch und wenn, ist es möglich, beschriften und MCCs in Vivo16,28,37,38zu analysieren.
Das oben beschriebene Protokoll ist für die Kennzeichnung MCCs in der Pronephros mit odf3b Transkripte und α-Tubulin in den 24 hpf Zebrafish Embryos optimiert. Die besten Ergebnisse zu erzielen empfiehlt es sich, frisch fest- und vorbereitete Embryonen zu verwenden. Embryonen, die wurden behoben, und gespeichert in MeOH oder Hyb + bei-20 ° C für mehr als 1 Woche können verwendet werden, aber die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten Hintergrund Färbung steigt mit der Zeit, die die Embryonen im Speicher gehalten werden.
Modifikationen und Problembehandlung für diese Technik sind notwendig, um diese Methode für andere Suiten des bestimmten Markierungen, z. B. andere antisense Riboprobes und andere Antikörper anpassen. Viele Methoden zur Anpassung der Parameter der Schritte im Prozess der ganze Berg in Situ Hybridisierung wurden bisher dokumentiert von unserer Fraktion und anderen31,34,36,38, 39. Ebenso jedes Protein Antikörper erfordert einige Fehlersuche in Bezug auf die Färbung Zeiten und ungefähre Reichweiten von Verdünnungen und Inkubationszeiten für jedes Primärantikörper dürften am besten durch Auswertung der dokumentierten Ergebnissen28, 35. für Embryonen jünger als 24 hpf, pK-Behandlung sollte kürzer sein als 2 min, wo Embryonen, die älter als 24 hpf mit pK für länger als 2 min behandelt werden sollte. Auch Embryonen älter als 24 hpf Pigment vor der pK-Behandlung gebleicht werden sollten.
Nach der Färbung mit fluoreszierenden Färbelösung, ist es wichtig, alle verbleibenden Fleck, Antikörper und Peroxidasen zu entfernen, indem die Reihe von Methanol und Wasserstoff-Peroxid wäscht. Die PBS-Wäschen unmittelbar nach sind entscheidend für überschüssige Methanol aus den Embryonen zu entfernen. Wichtig ist, bevor Sie mit der IF-Antikörper, haben wir festgestellt, dass das Aceton und deionisiertes Wasser wäscht die Embryonen seltener an einander und/oder die Zentrifuge Rohre halten machen. In unserer Erfahrung, Antikörper gegen bestimmte Transkriptionsfaktoren und andere Gene obwohl sie effizient arbeiten können, Western blots, funktionieren nicht gut denn wenn in der Zebrabärbling. Hoch konservierte und reichlich Proteine wie α-Tubulin und β-Catenin, funktionieren jedoch auch in der Zebrabärbling für IF16,37.
Mit Fisch ist es möglich, RNA-Transkripte von Genen zu visualisieren, die noch keine spezifische Antikörper in der Zebrabärbling haben. Durch die Kombination von Fisch mit IF, kann dieses Protokoll beweist Co Lokalisierung von RNA-Transkripte und Protein gesehen in Vivo (Abbildung 2). Die flexible Art des Protokolls ermöglicht schnelle Fehlersuche für die Visualisierung der verschiedenen RNA-Transkripte und Proteine in zahlreichen Geweben und Zeitpunkten. In Kombination mit den bereits angesehenen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryonen, bietet dieses Protokoll von Fisch + wenn ein weiteres Tool um die Expression von Genen und Proteinen wichtige entwicklungspolitische Weg Verordnung zu erkunden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Gewährung R01DK100237 R.A.W und der National Science Foundation Graduate Research Fellowship No unterstützt. DGE-1313583, A.N.M. Wir bedanken uns auch bei der Hochschule der Wissenschaft Sommer Undergraduate Research Fellowship Program zur Unterstützung der M.U. Wir möchten das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre Dame für ihre engagierte Betreuung unserer Zebrafisch danken. Wir möchten auch Danke, Abteilung der biologischen Wissenschaften sowie die Mitglieder unseres Labors für all ihre Unterstützung und wertvolle Einblicke.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |