속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.
최근 몇 년 동안, zebrafish 태아 배아 개발 utero 전 및 광학 투명도 같은 특성으로 인해 개발 생물학 공부를 인기 모델로 떠오르고 있다. 특히, zebrafish 태아 척추 신장 organogenesis multiciliated 셀 (MCC) 개발 공부 하는 중요 한 유기 체 되고있다. 배아 zebrafish 신장에서 MCCs를 시각화, 우리 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 결합 된 프로토콜을 개발 했습니다 하 고 전체 고해상도 이미징 수 있도록 면역 형광 (IF)를 탑재. 이 원고 공동 다양 한 혈통 요소의 표현을 통해 발달 프로그램의 규칙을 이해 하는 도구로 서 RNA 사본 및 단백질을 지역화 우리의 기술을 설명 합니다.
지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 개발 생물학을 공부 하는 주요 모델 생물으로 떠오르고 있다. 태아는 어머니 이상으로 개발 하 고 광학 투명. 또한, 눈, 신장, 개 등 중요 한 장기의 형성, 그냥 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된 구조와 발생 합니다. 중요 한 것은, zebrafish 게놈이 포유류1,2,3높은 보존 된다. 또한, 제 브라와 포유류 장기 비슷한 해부학과 생리학 있다. 제 브라 미 발달 신장, 또는 pronephros, 초기 nephrogenesis 및 척추 nephron4, 의 보존된 상피 세포 인구의 운명 결정 하는 동안 유전자 기능을 조사 하기 위한 모델 시스템의 값을 보여 줍니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 마찬가지로, zebrafish 태아 MCCs11,12,13,,1415, 의 그렇습니다 검사에 점점 더 중요 해지고 있다 16 , 17.
그들의 이름에서 알 수 있듯이, Mcc는 상피 세포 꼭대기 표면17에 있는 운동 속눈썹의 특징 이다. Zebrafish에서 MCCs 유체 흐름에서 작동 하 고 24 hpf11,12,,1314, “salt-and-pepper”는 pronephros의 각 nephron의 중간에 걸쳐 패션에 분산 되어 있는 15 , 16 , 17. 비록 그들은 단지 한 줌에 지적 되었습니다 인간 신장의 질병 케이스18,,1920,21, MCCs 두뇌 같은 다른 포유류 조직에서 유행 하 고 기관22,23,24, 실험 설계에 대 한 도전의 호스트 포즈는. Zebrafish를 포함 한 다양 한 척추 동물 모델에서 우아한 연구 노치 신호 전달 경로 고객 센터 개발12,,1725 의 억제제로 보존된 통로 MCC 운명의 증명 ,2627. 따라서, zebrafish pronephros MCC 개발 vivo에서11,12,,1314, 의 유전 메커니즘을 연구 하 쉽게 접근할 수 있는 모델 제공 15 , 16 , 17.
투명성과 zebrafish 태아의 쉬운 유전자 조작 입증 귀중 한 특성 세포 운명, 조직 성장, 및 초기 배아1,2 개발 유전과 분자 경로 공부를 할 때 ,3. 현장에서 교 잡 등 전체 마운트 경우 단백질 및 유전자 내용은 시각화에 적용 되었고 zebrafish16,,2829에 대 한 최적화를, 전통적인 기법으로 30,31,32,33,34,35,36,,3738. 물고기와 IF에 대 한 인기 있는 프로토콜을 결합 하 여 레이블 및 Mcc vivo에서16,28,,3738분석 하 가능 하다.
위의 상세한 프로토콜 pronephros odf3b 성적표와 α-tubulin 24 hpf zebrafish 태아에 있는 MCCs를 라벨에 대 한 최적화 됩니다. 최상의 결과 얻으려면 갓 고정 하 고 준비 된 배아를 사용 하는 것이 좋습니다. 고정 되어 MeOH 또는 Hyb + 1 주 이상-20 ° C에서 저장 된 배아 배아 저장소에 유지 됩니다 시간 증가 얼룩 원치 않는 배경의 확률만 사용할 수 있습니다.
수정 및이 기술의 문제 해결 특정 마커, 예를 들어 다른 센스 riboprobes 및 다른 항 체의 다른 제품군에 대 한이 메서드를 조정할 필요가 있습니다. 전체 산 현장에서 교 잡 과정 단계 매개 변수를 조정 하기 위한 많은 방법이 있다 이전 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해31,,3436,38, 문서화 39. 마찬가지로, 각 단백질 항 체 얼룩이 번, 측면에서 몇 가지 문제 해결 필요 합니다 하 고 희석 및 보육 시간 각 1 차 항 체에 대 한 대략적인 범위는 최고의 문서화 된 결과28, 의 평가 의해 추정 35. 24 미만 태아에 대 한 hpf, pK 치료 2 분 보다 짧은 있어야 어디 24 보다 오래 된 배아 hpf pK 2 분 이상 대우 되어야 한다. 또한, 24 보다 더 오래 된 배아 hpf pK 치료 하기 전에 안료의 표백 한다.
형광 성 얼룩 솔루션 얼룩 후 메탄올과 과산화 수소 세척의 시리즈를 수행 하 여 모든 나머지 얼룩, 항 체, 및 peroxidases를 제거 하는 중요 한 이다. 바로 다음 PBS 세척은 배아에서 초과 메탄올을 제거 하는 중요 한. 만약 항 체를 계속 하기 전에 중요 한 것은, 우리는 그 아세톤 및 이온된 수 세척 배아 서로 또는 원심 분리기 튜브 준수 하 게 발견 했다. 우리의 경험, 특정 전사 인자와 다른 유전자에 대 한 항 체에 그들은에서 효율적으로 일할 수 있습니다 비록 서양 지우고에서 zebrafish에 경우에 잘 작동 하지 않습니다. 그러나, 매우 보존 하 고 풍부한 단백질, tubulin α 및 β-catenin 같은 경우16,37제 브라에서 잘 작동지 않습니다.
물고기, 그것 되지 않은 아직 특정 항 체는 제 브라에서 유전자의 RNA 사본을 시각화 가능 하다. 경우 물고기를 결합해 서,이 프로토콜에 의해 증명으로 볼 vivo에서 (그림 2) RNA 사본 및 단백질의 공동 지역화 될 수 있습니다. 프로토콜의 유연한 특성 다양 한 RNA 사본 및 수많은 조직 및 시간 포인트에서 단백질의 시각화에 대 한 빠른 문제 해결 수 있습니다. Zebrafish 태아의 이미 존경 받는 특성 결합, 생선 + IF이이 프로토콜 유전자와 단백질 중요 한의 식을 발달 통로 규제를 탐험 다른 도구를 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 원시와 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 제를 부여 R01DK100237에 의해 부분적으로 지원 A.N.M. DGE-1313583 우리는 또한 대학의 과학 여름 학부 연구 친교 프로그램 M.U. 지원 위한 감사 합니다. 우리는 Zebrafish의 Notre Dame 대학 우리의 zebrafish의 전용된 그들의 관리에 대 한 연구는 센터를 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 생물 학적 과학의 부서 뿐만 아니라 그들의 지원 및 중요 한 통찰력의 모든 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |