纤毛发育对正常器官的形成至关重要。该协议描述了一种优化的方法来标记和可视化纤毛细胞的斑马鱼。
近年来, 斑马鱼胚胎已成为一个流行的模式, 研究发展生物学, 由于特点, 如前子宫胚胎发育和光学透明度。特别是斑马鱼胚胎已成为研究脊椎动物肾脏器官和 multiciliated 细胞 (MCC) 发育的重要机体。为了可视化监控器在胚胎斑马鱼肾脏, 我们已经开发了一个联合协议的全贴装荧光原位杂交 (鱼) 和全贴装免疫荧光 (如果), 使高分辨率成像。这份手稿描述了我们的技术 co-localizing RNA 转录和蛋白质作为一个工具, 以更好地理解对发展计划的调节, 通过表达各种血统因素。
在过去的几十年中, 斑马鱼 (斑马鱼) 已经成为研究发育生物学的主要模型生物体。胚胎在母亲的外面开发并且是光学上透明的。此外, 眼部、肾脏和前脑等重要器官的形成也迅速发生, 其结构由仅 24 h 后受精 (hpf) 组成。重要的是, 斑马鱼基因组是高度保守的哺乳动物1,2,3。此外, 斑马鱼和哺乳动物的器官也有相似的解剖和生理学。斑马鱼的胚胎肾脏, 或 pronephros, 证明了模型系统的价值检测基因功能在早期 nephrogenesis 和命运确定的保存上皮细胞种群的脊椎动物肾单位4,5,6,7,8,9,10. 同样, 斑马鱼胚胎在检查监控化学品的个体发育中变得越来越重要11、12、13、14、15、16,17。
正如他们的名字所表明的, 监控化学品是上皮细胞的特点是一束运动纤毛位于顶端表面17。在斑马鱼中, 监控化学品在流体流动中的作用, 并在 pronephros 的每一个肾单位的中间分布着一个 “salt-and 胡椒”, 24 hpf11,12,13,14,15,16,17. 虽然它们只在少数人类肾脏疾病病例中被注意18、19、20、21, 但在其他哺乳动物组织 (如大脑和气管22,23,24, 这给实验设计带来了许多挑战。优雅的研究, 包括斑马鱼在内的各种脊椎动物模型显示了 mcc 命运的保守通路, 以缺口信号通路作为 mcc 的抑制剂开发12,17,25 ,26,27。因此, 斑马鱼 pronephros 提供了一个易于访问的模型来研究 MCC 发展的遗传机制在体内11,12,13,14,15,16,17。
在研究控制细胞命运、组织生长和早期胚胎发育的基因和分子通路时, 斑马鱼胚胎的透明和容易的基因操作已经证明是非常宝贵的特性1,2 ,3。因此, 传统的技术来可视化蛋白质和基因转录, 如原位杂交和整个装载如果, 已被应用到和优化斑马鱼16,28,29, 30,31,32,3334353637通过结合流行的鱼的协议和如果, 它是可能的标签和分析监控化学品在体内16,28,37,38。
上面详细的协议是优化的标签在 pronephros 与odf3b转录和α-蛋白在 24 hpf 斑马鱼胚胎。为了取得最佳效果, 建议使用新鲜固定和准备好的胚胎。胚胎被固定和储存在甲醇或 Hyb + 在-20 ° c 超过一周可以使用, 但不必要的背景染色的概率增加的时间, 胚胎保存在储存。
这项技术的修改和故障排除是必要的, 以便为其他特定标记 (例如其他反义 riboprobes 和其他抗体) 量身定做这种方法。在整个装入原位杂交过程中, 许多调整步骤参数的方法已经被我们的组和其他人记录下来了.31,3436,38, 39。同样, 每种蛋白质抗体都需要在染色时间方面进行一些故障诊断, 而每个主要抗体的稀释和潜伏期的近似范围最好通过对记录结果的评估28,35. 对于小于 24 hpf 的胚胎, pk 治疗应短于2分钟, 其中超过 24 hpf 的胚胎应以 pk 治疗超过2分钟。此外, 早于 24 hpf 的胚胎应在 pK 治疗前漂白色素。
染色后的荧光染色溶液, 这是至关重要的, 以消除任何残留的污渍, 抗体和过氧化物, 执行一系列的甲醇和过氧化氢洗涤。紧接着的 PBS 冲洗是从胚胎中去除过量甲醇的关键。重要的是, 在进行 IF 抗体, 我们发现, 丙酮和去离子水冲洗使胚胎不太可能坚持彼此和/或离心管。在我们的经验中, 特定转录因子和其他基因的抗体, 虽然它们可能有效地在西方的印迹, 如果在斑马鱼的效果不好。然而, 高度保守和丰富的蛋白质, 如α-蛋白和β-蛋白, 在斑马鱼的工作很好, 如果16,37。
有了鱼, 就有可能想象出在斑马鱼身上还没有特定抗体的 RNA 转录基因。通过结合鱼类与 IF, 如本议定书所示, 共存的 RNA 转录和蛋白质可以看到在体内(图 2)。该协议灵活的性质, 使快速故障排除的各种 RNA 转录和蛋白质在许多组织和时间点的可视化。当与已有的斑马鱼胚胎的特征相结合时, 本议定书的鱼类 + 如果提供了另一种工具来探索基因和蛋白质的表达对发育途径的重要调节。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到部分支持的赠款 R01DK100237 R.A.W. 和国家科学基金会研究生研究金 No。DGE-1313583 至 A.N.M。我们还感谢科学学院暑期本科生研究奖学金计划, 支持 M.U。我们要感谢在圣母大学的斑马鱼研究中心对我们的斑马鱼的专门护理。我们还要感谢生物科学系以及我们实验室的成员们所提供的所有支持和宝贵的见解。
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |